分享的是一篇发表在Mol Plant上的文章，通讯作者是赵乔研究员。赵乔研究员是中国科学院深圳先进技术研究院合成基因组学研究中心主任、研究员，主要研究方向为植物糖基转移酶功能解析、芳香族氨基酸合成与代谢途径解析、植物人工染色体重塑信号和代谢通路应用。在本文中，作者提出了一种结合糖苷特异性代谢组学和前体同位素标记分析手段用于表征拟南芥中尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶（UGTs）的方法，并解析了该类UGT的遗传学功能，为其他糖基转移酶的发现及表征提供了范式。

植物的次生代谢物往往带有甲基化、酰化及糖基化修饰，这类丰富的修饰为这些次生代谢物多样化的生物学功能提供了结构基础。植物中的糖基化通常由尿苷二磷酸（UDP）依赖性糖基转移酶（UGTs）催化，其为糖基转移酶家族1的成员，可催化活化的糖供体将糖基转移到代谢物、植物激素等受体分子，并影响激素稳态，溶解度，细胞定位和生物活性。在植物中，葡萄糖是最常用的糖供体，而木糖，半乳糖，鼠李糖，阿拉伯糖和葡萄糖醛酸也可被植物UGT利用。大多数UGT进行O-糖基化，但N-，S-或C-糖基化也可能发生。由于UGTs的底物可用性通常与特定的细胞背景有关，植物的UGTs在体外酶活测试中往往表现出很低的底物特异性，这一特点也为其体内真正的糖基化底物的鉴定过程造成了困难。

植物代谢组学的进步为植物糖基转移酶的底物鉴定提供了许多帮助，但鉴于植物内存在大量未知代谢物，其代谢组分析是一个巨大的挑战。作者参考了如下的思路来进行UGTs的糖苷特异性代谢组学（GSM）表征：基于内源碰撞诱导解离（ISCID）的液相色谱- 高分辨率质谱（LC-HRMS）的非靶向修饰特异性代谢组学可以特异性地分析修饰的代谢物：在ISCID过程中，内源性代谢物的酰基，核糖基，磺基和葡萄糖基等附着修饰部分可以通过具有特定模式的中性质量损失途径去除；而非靶向修饰特异性代谢组学方法可以用于绘制糖基化代谢物图。类似于上述策略，UGTs的内源性代谢物糖基化在底物中增加了一定的分子量，而这一部分的分子量可以在ISCID过程中去除，并产生特异性的中性质量损失模式作为糖基化鉴定的指标。此外，稳定同位素标记也可被用于帮助阐明由特定代谢前体产生的植物代谢物的结构，以协助解析植物中的未知代谢物信息。作者结合了前体同位素标记（GSM-PIL）分析来阐释UGT功能。本文的第一个案例选择了苯基丙类化合物途径进行研究，苯基丙类化合物途径介导了多种次级代谢物的生物合成，其中糖基转移酶UGT72E已被证明可以糖基化几种苯基丙类化合物：从苯丙氨酸（Phe）衍生的单木酚、针叶醇和芥子醇在拟南芥的光生长根中可以作为糖苷积累，且所有UGT72E表达减少的转基因植物具有针叶醇和芥子醇4-O-葡萄糖苷水平降低的性状。作者基于上述发现，生成了ugt72e1e2e3三突变体，并通过GSM分析发现ugt72e1e2e3突变体中至少64种糖苷出现了显著减少。通过[¹³C₆]-Phe前体的同位素标记，证明了这64种糖苷中的22种是Phe衍生的糖苷。该方法表明，UGT72Es不仅可以参与单木质酚糖苷的合成，还可以产生木质素生物合成途径中的糖苷，包括5-OH针叶醇和木酚素衍生的糖苷。来自木质素生物合成途径不同分支的香豆素也被GSM分析鉴定为UGT72E1–E3的产物，且UGT72E1–E3的过表达可导致碱性条件下的低铁耐受性增强，这也为UGT72E参与香豆素糖基化提供了功能证据。作者还利用这一方法评估了UGT78D2的功能，表明该方法可特异性分析糖基化代谢物，是全面表征UGTs在植物体内功能的有效方法。

拟南芥苯基丙类化合物途径与UGT72Es催化的代表性糖苷示意图

首先，作者通过GSM-PIL分析研究了UGT72Es在植物体内介导的糖基化。作者通过T-DNA插入获得了ugt72e1e2e3三突变体并通过q-PCR验证了其UGT表达水平的降低。作者使用基于CID的四极杆飞行时间质谱进行了代谢组分析，通过葡萄糖基化/半乳糖基化，鼠李糖基化，阿拉伯酰基化/木糖基化和葡萄糖醛酸化代谢物的特定中性质量损失实现对代谢物的鉴定。作者从Col-0和ugt72e1e2e3突变体根部提取物的鉴定结果中，通过单因素分析过滤筛选出100个糖苷代谢物候选，并在ugt72e1e2e3突变体中通过MS/MS质谱进一步鉴定，最终由特征NL片段鉴定出64种被确认为糖苷的代谢物。

通过 GSM-PIL 分析表征 UGT72E流程示意图

在ugt72e1e2e3突变体中鉴定出的糖苷类型、数量及部分典型糖苷的质谱数据

通过GSM-PIL分析识别UGT72E的潜在产物（C4-C18）

接着，作者测试了UGT72E的体外、体内活性及功能。作者测试了UGT72E1-E3对叶醇、阿魏酸、羊毛嘧啶醇等市售底物的酶活性，通过UPLC-QQQ-MS/MS检测反应生成的对应底物，验证了UGT72E1-E3的体外酶活。作者生成了UGT72E1-E3的过表达（OE）谱系，并在各个品系中验证了对应糖苷含量的明显下降，作者回补对应UGT72E1-E3 cDNA后通过qPCR分析发现UGT72E1-E3表达水平恢复，对应糖苷含量也随之提升。此外，作者检测了UGT72E突变对转录组的影响，发现苯基丙类生物合成途径中没有其他UGT在ugt72e1e2e3突变体的根部出现差异表达。这一结果表明，Phe衍生糖苷的生物合成受损不太可能是UGT72E1–E3以外的UGT基因表达改变的结果。综上，作者通过UGT72E的体外体内功能验证进一步证明了UGT72Es表征结果的可靠性。

不同品系中已鉴定的Phe衍生糖苷的相对水平

然后，作者研究了UGT72E1–E3参与香豆素糖基化并在低铁条件下影响铁（Fe）获取的作用。作者先证明了3个UGT72Es在体外对香豆素苷元的葡萄糖基转移酶活性，并分析了Col-0型拟南芥和ugt72e1e2e3突变体在低铁环境下的表型差异，发现UGT72E1–E3是香豆素糖基化所必需的，且对于难吸收铁的摄取具有重要意义。

拟南芥UGT72Es可催化香豆素糖基化以在低铁环境下增加铁的可用性

通过GSM-PIL分析对UGT78D2进行表征

综上，GSM-PIL方法极大地扩展了UGT介导的糖基化的鉴定范围，增加了糖苷代谢物鉴定的准确性，且该策略具有成为UGT功能表征的通用性策略的潜能。这一策略的提出使人们有机会进一步了解糖基化网络的复杂结构，并且可扩展到目前仍难以探索的多种代谢途径。

文章作者：CZH

原文引用：10.1016/j.molp.2022.08.003

责任编辑：LD