分享一篇2022年发表在Sensors and Actuators B：Chemical上的文章，题目是“Optical tweezers assisted analyzing and sorting of tumor cells tagged with fluorescence nanospheres in a microfluidic chip”。武汉大学的吴琼水、庞代文和唐宏武是本文的共同通讯作者。单个肿瘤细胞的检测和分析对于癌症患者的早期诊断、预后评估、个体化治疗和转移机制的研究具有重要意义。近年来，细胞分离和浓缩的方法多种多样，主要是基于肿瘤细胞的物理性质和生物亲和力。建立一种物理分析和化学检测相结合的策略来进行进一步的分类和分析是一项有意义和挑战性的工作。因此，作者建立了基于微流控芯片和荧光纳米球标记技术的FACS-OT检测平台，用于模拟乳腺癌标本中肿瘤细胞的检测和分选。首先他们构建了一个多功能光镊平台，用于检测和捕获微流控芯片中的目标细胞。然后，用包埋法制备的双色荧光纳米球标记两种不同表达水平的肿瘤标志物蛋白，并用抗CD45单抗(CD45，高表达白细胞，Jurkat T)和抗EpCAM单抗(EpCAM，上皮性细胞黏附分子，高表达乳腺癌细胞，MCF-7)进行共价偶联修饰。在微流控芯片中，单排细胞样品通过流体动力聚焦依次通过主通道的检测区和捕捉区。通过对测试条件的优化，在稳定的速度场下采集了生物和物理性质相结合的多路信号，并确定了下一步的阈值和延迟时间。最后，OT根据阈值和延迟时间开启，通过自动检测和分析来实现对特定细胞的捕获和偏转。随后，结合实验数据和仿真结果对平台的性能进行了评估，为多功能平台在分选细胞领域的进一步应用奠定了基础。
图 1.FNs的表征。（A）FNs的TEM图像，比例尺：100 nm。（B）FNs的荧光显微图像，比例尺：10μm。单个FN的插图，比例尺：500 nm。（三）FN的荧光光谱（左：GNs，右：RNs）。
首先，作者制备了含有量子点的共聚纳米球，如图1所示。然后采用共价偶联的方法对制备的免疫球蛋白和免疫球蛋白进行了修饰。以高表达EpCAM的MCF-7细胞为靶细胞，CD45高表达的Jurkat T细胞为正常对照细胞，研究探针的特异性。根据图2A中的荧光显微镜图像，Jurkat T细胞与免疫球蛋白孵育后，在其表面观察到明显的绿色荧光信号。而MCF-7细胞与IRN孵育后，在细胞表面观察到明显的红色荧光信号。在相同条件下，当GNS和RNS分别与Jurkat T细胞和MCF-7细胞孵育时，在其表面没有观察到荧光信号，表明GNS-抗CD45或RNS-抗EpCAM与Jurkat T或MCF-7细胞的结合是有效的和特异的。此外，如图2B和2C，他们还用Image J软件对含有IFN和FNS的MCF-7细胞和Jurkat T细胞的荧光强度进行了计数，表明纳米探针对肿瘤细胞和正常细胞进行了特异性标记。
图 2.（A）基于IFNs的标签策略的特异性和有效性。Jurkat T和MCF-7细胞与GNs，GNs-抗CD45，RNs和RNs-抗EpCAM从上到下孵育的显微图像。比例尺：50 μm。（B）与GNs和GNs抗CD45一起孵育的Jurkat T细胞的荧光强度分析。（C）与RNs和RNs-抗EpCAM一起孵育的MCF-7细胞的荧光强度分析。
为了确定自制装置的可行性，通过对微流控芯片中的细胞进行荧光纳米球标记，作者建立了FACS-OT平台。在该平台中，用不同的抗体修饰双色荧光纳米球来特异性地识别和标记微流控芯片中的不同细胞。首先，为了验证多功能光镊装置的性能，用GNS处理的Jurkat T细胞作为对照组，用IGNs处理的T细胞作为实验组，进行单细胞荧光信号检测，如图3A和3B所示，对照组在双通道检测器中没有明显的荧光信号。相比之下，实验组的结果显示，在绿色荧光通道窗口中可以获得大量的荧光峰，而在红色荧光通道窗口中在5min内只出现了少量的干涉信号峰。同样，以RNS为对照组的MCF-7细胞和以IRNS为实验组的MCF-7细胞也进行了单细胞荧光信号检测，如图3C和3D，对照组的MCF-7细胞在双通道检测器中没有显示出明显的荧光信号，但实验组在红色荧光通道窗口中出现了大量的荧光峰，只有少量的干扰出现在绿色荧光通道的相应位置。以上结果表明，在双色荧光通道检测中没有明显的串扰现象，可以清晰地区分实验组和对照组的荧光信号，进一步验证了荧光纳米球标记策略的特异性，也为后续的双通道荧光同时检测奠定了良好的基础。
图 3.细胞表面生物标志物的荧光检测。用GNs（A）处理并与GNs-抗CD45（B）孵育的Jurkat T细胞的荧光测量。用RNs（C）处理并与RNs-抗EpCAM（D）孵育的MCF-7细胞的荧光测量。荧光同时测量与GNs-抗CD45和MCF-7细胞一起孵育的Jurkat T细胞，与RNs-抗-EpCAM孵育10分钟（E）和1分钟（F）。
然后，为了评估自制装置的稳定性和准确性，将IGNs处理的Jurkat T细胞和IRNs处理的MCF-7细胞的混合物取样到微流控芯片中进行单细胞检测。如图3E所示，双通道荧光检测结果表明，高频采集到了10分钟的双色荧光信号。此外，如图3F所示，1分钟的检测结果显示，双通道荧光检测峰之间不存在重叠，说明了单细胞检测的准确性。同时，他们还验证了该方法的实用性。如图4A所示，光学捕获器是关闭的，由于缺乏光学捕捉力，单细胞通过捕捉区并且其轨迹不会改变并流入废物通道I。相反，如图4B所示，由于施加在单元上的光陷力，保持光学捕获，直到在预置区域中稳定地捕获单个单元。根据图像，由于沿光传播方向的散射力将被捕获的细胞稍微推开，使稳定的捕获平面和成像平面不重叠，细胞和光镊的焦平面略有不同。此外，如图4C所示，一叠随时间变化的图像清楚地显示，当按照软件的指令将光学捕捉从打开打开到关闭时，细胞逐渐进入光学捕捉，并被稳定地捕捉短时间，然后被快速释放到收集通道II中。在上述测试的基础上，根据视频监控，当光学捕捉关闭时，近100%的细胞流入废旧通道I。相反，如图4D所示，当开启光学捕获时，95.7%的细胞流入收集通道II。
图 4.（A）光镊（OT）关闭：流动的单元进入废物通道（I.）。（B）OT开启，细胞稳定被困。（C）OT从ON到OFF：流动的细胞进入收集通道（II.）。（D）当OT打开或关闭时，I.或II.中的单元格的比率。（E）从检测区域到陷阱区域（红色圆圈）的距离用蓝线表示。黄色箭头表示流向。
为了实现光镊对细胞的分选，让细胞依次流经检测区和捕捉区。根据阈值条件的设置，由自制软件确定目标信号，光镊接收指令，根据延迟时间及时开启，实现目标细胞的捕获和偏转进入采集通道。相反，如果检测区域中的信号不是来自目标细胞，则光镊将不接受指令，信号采集系统进行下一轮目标细胞识别。通过对某些细胞的自动分析和偏转，计算了微流控芯片出口的细胞数量，能够进一步验证仪器的准确性和更好的应用。
综上所述，他们通过将光镊系统与单细胞微流控分析技术和荧光纳米球标记技术相结合，成功地开发了FACS-OT平台。与目前主要依赖于多步骤和复杂设置的检测方法相比，他们的策略在很大程度上集成了程序，并提供了包括单个细胞检测和捕获在内的自动化分析。该方法可实现对双色荧光信号的自动分析和识别，在光学力的照射下，目标细胞的偏转率可达95.7%。相信该平台将是一个很有前途的单细胞分析工具，对于细胞分选和检测能优于其他常规的方法。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2022.132173
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