为大家分享一篇发表在Nat Chem Biol上的文章，文章的题目是“Laboratory Evolution of a Sortase Enzyme that Modifies Amyloid β-protein”。这篇文章来自哈佛大学David R. Liu团队，利用酵母表面展示系统，对细菌转肽酶A的开展了定向进化，用来识别内源性Amyloid β的LMVGG序列，优化了针对癌症聚糖的功能治疗抗体，可用于胰腺癌和结直肠癌的治疗。分选酶转肽酶是广泛分布在革兰氏阳性细菌中的酶的超家族。金黄色葡萄球菌分选酶 A （SrtA） 负责将含有 C 末端 LPXTG 分选序列的蛋白质附着到细胞壁上。SrtA在识别序列的苏氨酸和甘氨酸之间切割，形成酰基酶中间体，随后酰化肽聚糖的五甘氨酸的伯胺。SrtA对LPXTG序列表现出强烈的偏好。有研究表明，SrtA会接受多种亲核试剂。这些特性使SrtA成为位点特异性蛋白质修饰的有吸引力的工具。这篇文章试图改变SrtA的特异性，以共价修饰阿尔茨海默病相关的β淀粉样蛋白（Aβ）。中枢神经系统中Aβ斑块的形成是阿尔茨海默病（AD）的标志。尽管Aβ具有临床重要性，但其生理功能和在AD发病机制中的作用尚不清楚。由于Aβ单体主要位于细胞外，并且包含与sortase的天然识别序列具有相同特征的五氨基酸序列，若通过定向进化获得特异性修饰Aβ位点的sortase，则可能有助于阐明其生物学作用，阻碍Aβ斑块形成，或促进对AD发病机制的理解。这篇文章试图使用酵母展示和荧光激活细胞分选 （FACS）进化出修饰Aβ的SrtA变体。具有N末端的三甘氨酸肽偶联的分选酶变体库结合在酵母表面，然后将文库与N-末端生物素化靶底物和非生物素化的脱靶底物一起孵育。催化三甘氨酸和靶底物之间转肽的分选酶变体对编码它们的酵母细胞表面进行生物素化。用TEV蛋白酶去除细胞表面显示的分选酶后，用荧光团连接的链霉亲和素染色细胞，并通过FACS分离编码活性和选择性分选酶变体的生物素化细胞。文章以前期进化出的酶4S.6作为本次定向进化的起始酶，通过降低靶底物的浓度、增加非靶底物的浓度，以及减少处理时间等方式，筛选的严格程度逐渐加大。经过16轮进化，获得了单克隆SrtAβ，对LMVGG的偏好是LPESG的30倍，其中的6个突变使可使SrtAβ的活性下降一半以上，单个突变产生的改变效果虽然很弱，但是多个突变同时出现可显著改变酶的特异性。接下来，这篇文章试图证明在脑脊液中开展内源性Aβ的标记。使用Aβ特异性免疫测定法测量CSF样品中的Aβ水平。用SrtAβ分别和GGG以及半合成的AβM1–37-GGGK（Btn）处理样品后，都观察到了预期的信号变化，证实该酶在脑脊液中具有活性。最后，文章试图试图将Aβ与阻碍其聚集的分子偶联，希望用更多的亲水残基替换疏水性C端残基，进而改变所得肽的聚集倾向。因此文章用SrtAβ和GGGRR过夜处理Aβ40，GGGRR取代Aβ42的最后五个残基GVVIA。使用连续的硫黄素 T （ThT） 结合测定，发现SrtAβ修饰的肽需要更长的时间才能成核成聚集体。这些结果建立了使用实验室进化的分选酶将疾病相关形式的 Aβ 修饰成不易通过转肽聚集的形式。这篇文章利用酵母表面展示平台，经过16轮进化，获得了一种Sortase变体SrtAβ，对LMVGG的倾向性是LPESG的30倍，特异性发生了很大变化。SrtAβ还可以将肽与人脑脊液中的内源性Aβ偶联，提高了生物医学在内源性Aβ上应用的可能性，可能有助于开发新的AD治疗方法。原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7904614/原文引用：doi.org/10.1038/s41589-020-00706-1
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