分享一篇发表在ACS Central Science上的文章“Activity-Based Hydrazine Probes for Protein Profiling of Electrophilic Functionality in Therapeutic Targets”，本文通讯作者是来自宾夕法尼亚大学化学系的Megan L. Matthews教授。她的主要研究方向是结合酶学和化学生物学以开发新的化学蛋白质组学技术，用来发掘新的酶辅助因子和翻译后修饰。在这篇文章中，他们报道了使用富电子的联氨探针共价捕获多种具有缺电子辅因子的酶类，对亲电性蛋白质组进行分析。
大多数已知的基于活性的蛋白质分析 (Activity-Based Protein Profiling, ABPP) 探针使用亲电基团标记某一类亲核氨基酸来识别其高反应性功能位点。与之相对的是，在常见的氨基酸及其肽键中基本上不存在反应性亲电基团，但许多重要的生物化学反应来源于蛋白质中亲电性的酶辅因子、瞬态中间体和不稳定翻译后修饰，此类亲电基团的ABPP探针开发很少被关注。富电子的联氨（肼）探针曾被用于发现酶上的N端乙醛酰 (Glox) 修饰，作者对联氨基探针进行了改进，使其类似于脑渗透性肼药物，以广谱性地对细胞中蛋白质组进行表征。
使用联氨探针在人类细胞中进行蛋白质组靶向分析，作者发现探针靶标中包含先前研究中发现过的两类位点和改进后探针新发现的六种位点。为了了解这些结构和功能不同的靶点是如何被同一组探针捕获的，作者通过过表达部分蛋白确定了探针和酶连接的位点及化学性质，以尝试总结其共性。随后他们发现，虽然联氨探针的最初应用是为了鉴定极性亲电位点，然而实验中命中的靶标也证明了该探针氧化活化的潜力。即探针有两种反应模式:直接极性耦合(direct polar coupling, DPC)和氧化分裂耦合(oxidative fragmentation/coupling, OFC)。DPC是通过 N-N 桥将连接有炔基的探针直接连接到酶上，OFC则诱发探针的 C-N 键断裂，最终导致其结构中的炔基部分直接通过 C-C 偶联连接上去。
基于上述机制的发现，作者还提出了确定共价修饰位点和联氨探针反应方式的实验策略。利用轻/重标签产生的MS1谱图对探针标记的多肽进行识别，随后根据15N标记探针时母体质量是否变化来区分一对肽的OFC和DPC反应类型。举例来说，在酶SCRN3中目标肽的质量发生了0.9970 Da的位移，说明联氨基团反应后被保留;而在FTO靶标中，肽段的质量没有变化，说明联氨基丢失发生了OFC耦合。
随后作者验证了该探针对这些不同酶靶点的广泛反应性是否是基于活性位点导向，并依赖于酶的功能状态——这是使经典ABPP探针成为抑制剂和药物发现强有力工具的两个关键特征。通过对来自六种不同结构和机制类别的酶进行凝胶分析证实了探针捕获需要酶处于活性、功能状态，也阐明了联氨作为酶靶标的通用共价修饰剂（和抑制剂）的潜力。总得来说，作者发现联氨探针不仅能够通过直接共价连接的方式捕获蛋白上的亲电性修饰，还能通过氧化偶联的方式与含有某些氧化还原相关辅因子的蛋白发生反应，且这些结合方式都依赖于蛋白活性。联氨探针的这些特性将有望用于后续更高选择性的探针开发及药物设计中。
本文作者：FTY文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.1c00616
原文引用：DOI: 10.1021/acscentsci.1c00616
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