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分享的文章发表在Journal of Biological Chemistry上，标题为Metabolic turnover and dynamics of modified ribonucleosides by 13C labeling，通讯作者是英国弗朗西斯·克里克研究所的Paulo A. Gameiro。
在RNA代谢的不同阶段，RNA甲基化调节关键的RNA-蛋白相互作用。第三代测序揭示了m6A（N6-甲基腺苷）在发育过程中的动态行为。但是，基于高通量测序（NGS）的分析得知，每种修饰都缺乏高特异性试剂，这使得量化甲基化水平的一般变化具有挑战性。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）是分析RNA修饰的一种高度准确的工具，它主要用于研究tRNA和rRNA，但由于严重修饰的ncRNA总是污染mRNA，质谱（MS）检测mRNA修饰是不可靠的。因此需要能够评估非稳态条件下对甲基化RNA转录和转录后影响的方法。
在本文，作者开发了一种使用[13C-甲基]-蛋氨酸标记和MS的定量方法，以评估新转录RNA中碱基修饰的转换。这种方法有助于从纯化后的RNA或游离核糖核酸样品中的ncRNA修饰中解析mRNA，并显示了polyA+ RNA中m6A与m7G（7-甲基鸟苷）修饰的不同动力学。最后，对这些修饰的转化率和丰度的联合测量分别反映了修饰的ncRNA和mRNA对应激条件的转录敏感性和转录后敏感性。这些结果为探索特定RNA修饰的存在和生物学调控开辟了新的方向。
作者首先进行了聚腺苷酸化和核糖体RNA修饰的13C标记，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是真核细胞中RNA甲基化反应的直接底物。为了追踪SAM掺入RNA，作者在补充未标记蛋氨酸（Unlab）和[13C-甲基]-蛋氨酸的培养基中培养786O细胞，并通过LC-MS/MS分析修饰和未修饰核糖核苷的同位素异数体（m+0，m+1，m+2）（图1A和图1B）。同时作者分析了polyA+ RNA、大RNA（> 200nt）和小RNA（< 200nt）中的m6A、m7G、m1A（1-甲基腺苷）、m62A（N6,N6-二甲基腺苷）、Am（2’-O-甲基核糖腺苷）、m5C（5-甲基胞嘧啶）和未修饰的核糖核酸。在[13C-甲基]-蛋氨酸标记4小时和24小时后，作者观察到来自polyA+ RNA和大RNA的修饰核糖核酸中的m+1部分增加，m+0部分减少，而未修饰核糖核酸的m+1部分在标记期间没有变化（图1C和图1D）。因此，相对于未标记的条件，（m+1）部分的变化表明新合成RNA的SAM依赖性RNA甲基化。与大RNA（>200 nt）和小RNA（<200 nt）相比，polyA+ RNA中m6A、m7G和m5C的同位素分数的定量显示出更快的动力学（图1E）。而在polyA+ RNA和大RNA组分之间，m1A、m62A和Am甲基化的动力学相似（图1E），这表明，与m1A、m62A和Am相比，m6A、m7G和m5C的mRNA相对于污染性ncRNA的相对丰度要高得多。另外，作者还发现在786O细胞的小RNA中检测到的m62A与大RNA相比有不同的动力学。
图1 RNA修饰的13C标记
接下来，为了检查甲基化转换的动力学，作者用[13C甲基]-蛋氨酸培养细胞24小时，然后用未标记的蛋氨酸替换，并随时间分析同位素异数体。作者观察到polyA+ RNA中m6A/m7G的（m+1）部分指数衰减而Am/m1A/m62A的（m+1）部分没有指数衰减（图2A）。相反，总RNA/大RNA的修饰表现出一致的缓慢周转（图2B），这与生长细胞中rRNA和tRNA的高稳定性一致。为了测试甲基化转换的动力学行为，作者检验了线性与指数回归线的拟合优度（图2C），残余误差分析表明，polyA+ RNA中Am/m1A/m62A的转换频率与ncRNA修饰相似，显著低于polyA+ RNA中的m6A或m7G，证实它们源自ncRNA污染。在polyA+ RNA中，m7G的标准化丰度介于m62A和m1A/Am之间（图2D），并且MS检测的灵敏度在除m5C之外的所有测量修饰中相似。相对于polyA+ RNA，Am/m1A/m62A/m7G的修饰核糖核酸在大RNA中更丰富，而polyA+ RNA中的m6A水平更高，为大RNA中的两倍（图2E）。
由于在polyA+ RNA中m6A的转换频率大约是ncRNA的8倍（图2A和图2B），作者推断代谢提取物中的游离核糖核苷主要来源于mRNA的内源性降解，而非ncRNA。因此，作者使用13C标记来检查游离核糖核苷的甲基化周转。作者发现13C标记后的快速动力学与m6A、m7G和Am相似，表明它们主要来源于相同的RNA类型（图2F-图2H）。有趣的是，m62A修饰还表现出比m1A或m1G（1-甲基鸟苷）更快的非线性动力学（图2F-图2H）。这些结果证实了Am在mRNA中的存在，并表明m62A在短寿命RNA中比m1A更常见。
图2 polyA+、ncRNA和游离核糖核苷库中修饰核糖核苷的周转
最后，作者测量了甲基化周转率和修饰核糖核苷的丰度，以了解mRNA与ncRNA对与RNA（去）甲基化相关的代谢应激的敏感性。作者已经证实放线菌素（ActD）能完全抑制polyA+和大RNA的甲基化周转（图3A）。用ActD处理降低了polyA+ RNA中m6A的标准化水平（图3B），但没有降低m7G的标准化水平，这支持了m6A在总mRNA失稳中的作用。丝氨酸或谷氨酰胺的剥夺主要抑制大RNA的甲基化周转（图3C和图3D），但大RNA中修饰的核糖核苷的丰度没有改变（图3E）。谷氨酰胺剥夺会导致polyA+ RNA中m6A水平增加（图3F），这与ActD处理的结果相反（图3B）。因此，大RNA甲基化周转的减少仅仅是由于rRNA自身的转录受到抑制，而m6A丰度的改变和其周转没有显著变化，表明其转录后对应激条件的不稳定性。
图3 应激条件下RNA修饰的动力学
综上所述，本文的研究表明，甲基化周转和丰度的量化可以用于检查RNA修饰的存在、它们的时间动态以及对压力条件的敏感性。这些见解为进一步探索质谱和正交方法以获得特定RNA信息开辟了新方向。
文章编号：142 原文链接： https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.101294 原文引用： Paulo A. Gameiro*, Vesela Encheva, Mariana Silva Dos Santos, James I. MacRae and Jernej Ule. Metabolic turnover and dynamics of modified ribonucleosides by 13C labeling. J. Biol. Chem, 2021, 297(5): 101294.
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