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介绍一篇 2022年发表在Nature Chemical Biology的文章，题目为 “Detection of cell–cell interactions via photocatalytic cell tagging”。作者提出了一种基于光催化、时间可控的细胞标记方法，用于细胞-细胞相互作用研究。该工作是由Merck公司的Olugbeminiyi O. Fadeyi、Rob C. Oslund和Tamara Reyes-Robles研究员共同完成的。
背景介绍 细胞与细胞间直接的相互作用在多细胞生物的发育和生物学功能中发挥着重要的作用。这些相互作用通过蛋白质、聚糖和脂质介导的物理接触产生，以形成稳定或者瞬时的细胞连接、黏附，实现细胞信号的传递以及更为复杂的细胞生理学功能。例如，在肿瘤微环境中，癌细胞、内皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用决定了肿瘤的进展。然而，由于突触的空间距离受到限制、涉及的细胞类型过多等问题，给检测这种物理上相互作用的细胞带来了困难。尽管基于酶的邻近标记策略和新兴的基于单线氧的光激活策略已被用于检测细胞间的相互作用，但这些策略通常依赖于对靶细胞进行基因改造或需要细胞表面存在特定的聚糖来引入细胞标记酶。因此，需要开发一种简单、模块化和非细胞干扰的标记方法，用于细胞-细胞间相互作用的研究。 设计思路 在这项工作中，作者开发了一种基于时间控制的光催化系统，用于捕获细胞间的相互作用，称之为光催化细胞标记（PhoTag）。PhoTag是基于黄素辅因子的光催化系统，可产生活性苯氧自由基，用于细胞间环境中的靶向蛋白标记（图1b）。其机制如图1c所示，黄素类似物（化合物1）在蓝光激发达到激发态（化合物2），激发态黄素（化合物2）催化生物素-酪胺分子（化合物3）生成苯氧基自由基中间体（化合物4），这一中间体可与邻近蛋白质上的酪氨酸、色氨酸残基生成苯酚加合物（化合物5），将生物素标签引入到特定细胞表面蛋白上。而黄素自由基（化合物6）可再生成基态黄素类似物（化合物1）以循环往复。 图1. PhoTag示意图 数据介绍 作者首先在纯蛋白体系下验证了PhoTag策略的可行性（图2a-c），发现蛋白质的生物素化程度可以通过催化剂浓度、光照时间及强度来调节，这与基于过氧化物酶的酶法不同。为了验证PhoTag是否可以用于检测细胞-细胞间相互作用，作者通过点击化学反应将黄素四乙酸酯（RFT）和二抗偶联（图2d），然后对活细胞进行了基于一抗/二抗的标记（图2e）。流式结果显示，可以利用PD-L1或CD86抗体和二抗-黄素偶联物在JY细胞上进行靶向标记；同样也可以利用PD-1或CD45抗体和二抗-黄素偶联物在Jurkat细胞上的靶向标记（图2f）。这些结果表明，PhoTag技术可实现不同细胞表面的生物素化标记。
图2.在纯蛋白体系下验证了PhoTag策略的可行性 接下来，作者利用表达PD-1的Jurkat T细胞（Jurkat PD-1）和表达PD-L1的Raji B细胞（Raji PD-L1）的共培养物系统来验证PhoTag策略是否能够实现细胞-细胞相互作用的捕获。虽然针对免疫突触的一抗/二抗PhoTag系统可成功标记细胞界面并实现跨细胞标记，但一抗/二抗PhoTag系统由于空间位阻较大，可能影响标记效果（图3a）。因此，作者直接将光催化剂RFT与抗体的VHH-Fc连接（VHH-Fc-RFT），VHH–Fc–RFT系统保留了一抗/二抗系统的主要设计，但分子量降低了四倍，流体动力学半径也相应减小（图3b-c）。随后，作者使用抗PD-L1 VHH-Fc-RFT在Jurkat PD-1/Raji PD-L1共培养系统中进行标记（图3d）。流式结果显示，该抗体可以靶向细胞表面的PD-L1，且不会阻断PD-L1与PD-1的相互作用（图3e）。共聚焦结果显示，Jurkat和Raji细胞接触区域之间具有高度选择性和光依赖的标记（图3f-g）。这些结果证明PhoTag系统能够实现细胞-细胞相互作用的捕获。 图3. PhoTag策略用于细胞-细胞相互作用的捕获 为了深入了解驱动T细胞和抗原呈现细胞（Antigen-presenting cells, APC）相互作用的因素，作者将基于PhoTag的细胞标记技术与单细胞测序结合，通过PD-1/PD-L1的相互作用来分析PBMC中的T细胞与Raji细胞的相互作用。作者刺激健康人的PBMCs诱导PD-1表达，然后与用抗PD-L1 VHH-Fc-RFT标记的Raji PD-L1细胞孵育，用于光催化细胞标记（图4a）。流式结果显示，与Raji PD-L1细胞相互作用的T细胞成功带上生物素标签（图4b）。此外，共聚焦成像分析显示生物素化定位在细胞连接处，类似于共培养系统（图4c）。以上结果说明，利用PhoTag细胞标记技术可以成功使与Raji细胞相互作用的T细胞便会带上生物素标签。接下来，在上述体系下，作者利用链霉亲和素修饰的寡核苷酸条形码对通过PhoTag策略带上生物素标签的T细胞进行编码，利用寡核苷酸条形码修饰的抗体对细胞表面蛋白进行编码，然后用抗-CD3磁珠富集T细胞，之后通过单细胞RNAseq评估每个细胞表面生物素化水平、蛋白表达水平和mRNA表达水平（图4d）。通过整合蛋白质和mRNA水平并进行聚类分析，作者发现了16个不同的细胞群（图4e），并且发现T细胞簇中显著富集了链霉亲和素标记的细胞（图4f）。最后作者评估了高链霉亲和素水平和低链霉亲和素水平的细胞簇中的基因表达差异（图4g）。以上结果说明，PhoTag的细胞标记技术与单细胞测序结合，使得由PhoTag标记的细胞可被富集、分类，分析。 图4. 利用PhoTag和单细胞测序分析PBMC 总结 本文介绍了一种简单、不受细胞扰动且高通用性的细胞标记技术PhoTag。该技术利用黄素辅助因子的光催化机理，可将生物素标记到相互作用细胞上，用于检测细胞-细胞间相互作用。此外，可将PhoTag技术与单细胞测序技术结合，对细胞相互作用进行更深入的研究，为探索免疫细胞相互作用提供了新策略。 原文链接 https://www.nature.com/articles/s41589-022-01044-0
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