介绍一篇2020年发表在Nature Methods上的文章，题目为“Massively parallel and time-resolved RNA sequencing in single cells with scNT-seq”，介绍了一种基于液滴微流控的高通量单细胞基因表达动态分析新方法。通讯作者为来自宾夕法尼亚大学的Hao Wu教授，该课题组主要研究方向包括时间维度的单细胞分析、表观调控机制以及干细胞中DNA修饰的研究等。课题组网页https://www.wulabupenn.org/
细胞内RNA表达水平的动态变化受多种调控因素的影响，为了解影响转录组表达水平的调节机制对细胞功能的影响，需要对不同种细胞的基因表达动态变化情况进行测定。目前用于分辨细胞新生转录本的方法基本依赖于外源核苷酸衍生物对细胞进行代谢标记，比如4sU等，通过化学修饰和逆转录过程可以将mRNA序列中的T碱基转化为C碱基，通过数据分析、和原基因组序列比对来判断新生转录本。本文结合RNA代谢标记、液滴微流控技术以及化学诱导的4sU转化为胞嘧啶衍生物的方法实现了单细胞中新旧转录本的同时检测，对RNA表达水平的动态变化、基因调控网络活性、细胞状态变化轨迹等进行分析，对比其他平台提高了通量、降低了成本，该方法命名为scNT-seq（single-cell metabolically labeled new RNA tagging sequencing, scNT-seq）。 作者采用了Drops-seq的方法进行单细胞转录组文库的构建，如图1a所示，主要包括了四个步骤：（1）用4sU对细胞内的新生转录本进行代谢标记，4sU（s4U）是一种尿苷的衍生物，在转录过程中4sU可以与DNA序列上的A碱基互补配对，进入新合成的RNA链中；（2）利用Drop-seq的液滴微流控平台将细胞和barcode beads共同包裹入液滴中；（3）细胞裂解，mRNA被编码微球捕获；（4）在barcode beads上进行4sU的化学转换反应，修饰后的4sU在逆转录过程与G碱基互补配对生成cDNA链；（5）逆转录，cDNA扩增以及建库测序。（6）利用数据分析，对reads中发生T碱基到C碱基转化的部分推测新生转录本的位置及信息。 为探究在编码微球上进行4sU化学转化的最佳反应条件，作者尝试了两种方法（SLAM-seq[1]采用的IAA转化方法以及TimeLapse-seq[2]采用的TFEA/NaIO4的方法），并且用小鼠胚胎干细胞以及人的K562细胞进行了物种分离实验。测序结果如图1b中所示，后者的方法明显好于前者，并且物种间mix比率与标准Drop-seq流程相当，验证了scNT-seq对单细胞转录组分析的可行性。此外，如图1c所示，通过scNT-seq成功检测到通过4sU的标记和TFEA/NaIO4的化学诱导形成的大量T碱基到C碱基的转化，经统计，细胞内能成功标记上4sU的转录本比例可接近50%（图1d），而未用TEFA/NaIO4处理的细胞则不可检测到4sU，证明了scNT-Seq平台利用液滴微流控和barcode beads能够在单细胞水平检测标记的新生的转录本的可行性。脊椎动物大脑中神经元的活性会引起上百个活性调控基因（activity-regulated genes，ARGs）的表达，促成新蛋白的合成以及表观调控的变化，不同的神经元活动模式会引发不同组合的ARGs表达，并且具有很强的细胞种类特异性。目前，原代皮层神经元细胞由活性诱导的基因表达模式已经被表征过，可以作为评估scNT-seq检测新生转录本灵敏度的模型，用于分辨新生转录本以及旧转录本。作者对培养的小鼠原代皮层细胞进行标记，并进行了不同时间的神经刺激（0、15、30、60以及120分钟），测序分析的结果如图2a所示，scNT-seq能够分辨出所有主要的细胞亚群。并且如图2b所示，无论分析对象是是总RNA或新生转录本，利用PCA分析，都可以分辨出激活状态和非激活状态的样品（120min与0min），同样对总RNA和旧RNA也可用PCA分辨激活与非激活的细胞，可能是由于部分旧转录本具有神经激活调控的稳定性。反之，非神经元细胞（Ex-NP/RG）没有展现出依赖于活性情况的细胞亚群分离趋势，如图2c所示，有些活性调控基因在神经元细胞中可以被成功诱导高表达（Jun和Btg2），但其他基因在其他非神经元细胞中也会被诱导发生表达水平的变化，展现了不同的变化趋势，而在旧转录本水平上，活性调控基因的表达情况几乎没有改变，因此scNT-seq成功检测到了细胞种类特异性的、活性诱导的转录组表达水平快速变化的情况。图2 scNT-seq可以捕获响应神经元激活的新生转录本的信息以及时间相关的调控子活性 转录因子（transcription factors，TF）的调控活性可以通过将顺式调控序列与单细胞基因表达情况相关联进行研究，通过联合分析新生转录本和旧转录本可以鉴定由外界刺激引起的动态调控子以及细胞个体相关的稳定调控子。如图2d所示，作者通过SCENIC（single-cell regulatory network inference and clustering）方法将单细胞的新生转录本与原有转录本进行匹配，共甄别出了79种共调节的TF调控子，其中包括受刺激后调控活性明显增强的TF以及持续表达的后转录激活的TF。与活性无关的转TF调控子是具有细胞类型特异性的，比如Ex的Neurod1/2以及Inh关联的Dlx1/2，和新生和原有转录本均有关，因此，scNT-seq可以在单细胞水平揭示细胞类型特异性的转录因子调控子活性的动态变化情况。（2）scNT-seq可以展现干细胞状态转变时的不同RNA调控策略 探究处于过渡状态的稀有细胞亚群的RNA调控策略对于理解细胞状态的转变至关重要。作者将scNT-seq应用至小鼠胚胎干细胞从多能态到全能态（2C-like state）转变过程中RNA的合成和降解调控机理的研究。作者采用了“pulse-chase”的策略来研究细胞状态特异性的RNA降解速率，如图3a所示，作者用4sU对细胞进行处理，分别在7个时间点对细胞进行回收，通过获取每个时间点、每个基因中4sU标记转录本的含量并绘制指数型衰减模型来计算每个细胞状态的mRNA半衰期。如图3c所示，在代谢标记24小时后，观察到了大量的T碱基到C碱基的转化。之后，作者计算了三种细胞状态（多能态，过渡态，全能态）的RNA合成和降解速率，并进行聚类，结果如图3e所示，展现了不同细胞状态间表达差异性最强的基因，并且通过计算合成和降解动力学之间相似性，鉴定出了三种主要的RNA调控策略，“cooperative”（共110个基因，在RNA生物合成和降解过程体现出负相关性）、“neutral”（共136个基因，在RNA降解速率与合成速率相比较时展现了较小的变化）以及“destabilizing”（共199个基因，在RNA的合成和降解过程中展现了正相关性）。其中，展现出某种特定细胞功能的基因也会被相似的RNA调控策略控制，比如，在展现“destabilizing”调控策略的基因中，作者判断出了mRNA可变剪切、转录调控以及核小体组装等功能的富集。以上结果证明，RNA合成以及降解过程中的变化都对干细胞状态转变的基因表达动力学有影响，scNT-seq可以成功应用至细胞状态转变时RNA表达调控策略的研究。图3 scNT-seq能够展现干细胞状态转化时的RNA的调控策略 本文将Drop-seq与TimeLapse相结合，发展了一种新的单细胞转录组动态变化分析新方法，具有高通量、简单、成本低的优势。将特定基因的新生转录本表达水平与TF相关联可以对在外界刺激或者细胞状态转变时TF调控子的活性进行研究，并且，利用“pulse-chase”的方法，scNT-seq可以准确评估RNA动力学参数，揭示稀有细胞亚群的RNA调控策略。scNT-seq还可以允许对mRNA进行双重标记，比如利用6-thioguanine来标记新生转录本（将G碱基转化为A碱基），因此可以通过不同的代谢标记方法在不同的时间点标记转录本，实现多个时间点的转录本同时分析，对研究复杂的RNA调控机制、预测细胞状态以及生物系统的动态变化提供了有力的工具。[1] Herzog, V., Reichholf, B., Neumann, T. et al.Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics. Nat. Methods,2017, 14, 1198–1204.[2] Schofield, J., Duffy, E., Kiefer, L. et al.TimeLapse-seq: adding a temporal dimension to RNA sequencing through nucleosiderecoding. Nat. Methods, 2018, 15, 221–225.原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0935-4
目前评论：