分享一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章“ACR-Based Probe for the Quantitative Profiling of Histidine Reactivity in the Human Proteome”。

蛋白质残留反应性的定量分析促进了用于精确治疗的共价药物靶点的发现。在20种蛋白质编码氨基酸中，组氨酸（His）是一种有用的催化成分，占酶活性位点的20%以上。His的咪唑侧链同时表现出较弱的亲核性和亲电性，导致残基反应活性较低。目前，His咪唑链与经典ABPP的亲电或亲核试剂之间仍难以形成稳定的键，由于缺乏标记探针，其活性尚未得到系统的表征。在此，作者通过丙烯醛（ACR）结合标记和可逆联氨化学富集，对His反应性进行位点特异性定量分析。

首先，作者研究His残基在生理条件下的标记效率。利用8种不同取代基的α、β-不饱和醛标记HeLa细胞裂解液中的蛋白质，使用可逆联氨化学法进一步富集标记肽，并进行MS进一步分析。观察到只有A1、 A2和A3这三个探针的标记效果不错，其中A1的标记最佳。因此选择这三个探针用于后续的实验。接着用牛血清白蛋白的标准蛋白中消化的多肽进一步评价了变性条件下ACR的标记效率，结果表明ACR对His具有较高的标记富集效率。因为ACR还能与Cys（占主要部分）和Lys残基发生反应，所以作者对ACR进行烷基化来避免Cys的干扰，采用碘乙酰胺（IAA）、氯乙酰胺（CAA）、n-乙基马来酰亚胺（NEM）、三种烷基化试剂对His进行了鉴定。与对照样品相比，只有NEM可以阻断Cys的残基，提高了His残基在反应性筛选中的识别范围。并且与ACR直接标记结果相比，NEM - ACR联合策略对His的标记和识别具有较高的覆盖率。

接下来将ACR标记用于His在人类蛋白质组中的反应性的全球定量分析。通过对比浓度依赖标记和ACR来评估His残基的内在反应性，其中高活性残基在低剂量时有望获得与His标记相似的标记效率，而活性较低的残基则表现出剂量依赖的变化。采用50μM（低剂量）和500μM（高剂量）ACR浓度对His进行位点特异性定量分析。对HeLa细胞蛋白提取、烷基化、富集及定量分析。总共对8222个His残基进行了明确定量。实验的结果覆盖了鉴定出的His残基的80%，表明His残基的标记和鉴定具有良好的重复性。且22%的蛋白质被鉴定出至少有4个His残基，证明了His残基表征的高覆盖率。

最后，对DrugBank数据库中收集的几千种蛋白质进行了分析，在上述实验结果中，3187个蛋白质中有8200多个His残基被测定。与基于Lys和Cys残基的结果相比，进一步发现了1354个蛋白质，其中1107个已鉴定的蛋白质未包含在DrugBank数据库中。又对His残基的磷酸化（恶性肿瘤的侵袭相关）做了相关测试，也取得了不错的效果。

总之，作者开发了一种基于ACR探针，用于在蛋白质组水平上定量分析His反应性。利用ACR探针展示了生理条件下His残基的特定位点标记，并结合可逆联氨化学富集。总共有超过8200个His残基被明确确定，包括许多先前未在Lys和Cys数据库中覆盖的不可药蛋白。

本文作者：WHF

责任编辑：FJY

DOI：10.1021/jacs.2c12653

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c12653