为大家分享一篇发表在mAbs上的文章，Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics[1]，文章的通讯作者是马萨诸塞大学阿默斯特分校的 Richard W. Vachet 教授。

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。

焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。

图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程。

在通过共价标记研究热应力利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。

随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。

图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。

活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。

图3. 使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。

55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的V_H和V_L结构域（图4）。加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在V_H、V_L和C_L域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。

图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。

尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是C_H3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。

图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。

DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

撰稿：王雅文，苏梓玲

编辑：李惠琳

文章引用：Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics