推荐一篇发表在Cell chemical biology上的文章，文章题目为“Redox proteomics combined with proximity labeling enables monitoring of localized cysteine oxidation in cells”，本文通讯作者为美国波士顿学院的Eranthie Weerapana教授，Eranthie Weerapana教授主要研究在于利用化学探针和化学蛋白质组学方法研究蛋白半胱氨酸活性等。
在病理或生理过程中，会产生活性氧（ROS），ROS可以氧化半胱氨酸残基以调节蛋白质功能，由于ROS的高反应活性以及体内大量抗氧化酶的存在，内源性ROS通常在时间和空间上高度定位，不同亚细胞区域会有独特的氧化还原环境和不同氧化水平的半胱氨酸残基，识别特定亚细胞区域和ROS热点内的半胱氨酸氧化水平是了解细胞ROS分布和扩散的关键。因此，在检测半胱氨酸氧化水平的氧化还原-蛋白质组学方法中引入空间限制条件是十分必要的。
目前已经开发出了许多化学工具和蛋白质组学技术来识别半胱氨酸氧化位点，本文作者选用的是OxICAT技术，典型的OxICAT的工作流程是先用轻标的N-乙基马来酰亚胺（NEM）来标记蛋白质组中所有的巯基，之后将被氧化了的半胱氨酸还原，再用重标的NEM标记被还原的半胱氨酸，之后进行定量质谱的分析就可以知道半胱氨酸的氧化百分比。然而，在这种全蛋白质组的分析中，丰度较高的胞质蛋白的信号会抑制低丰度蛋白质的信号，导致线粒体等亚细胞区室中低丰度蛋白的覆盖范围受到抑制。为了检测特定亚细胞区域的蛋白质中半胱氨酸氧化水平，作者将邻近标记技术与OxICAT联用，开发出了PL-OxICAT技术用来检测线粒体中半胱氨酸的氧化水平。首先，作者将TurboID与PDK1融合表达，得到线粒体基质定位的TurboID，与LACTB融合表达得到线粒体膜间隙定位TurboID，还做了一个胞质定位的TurboID作为对照。通过共聚焦荧光显微镜确认每种TurboID蛋白的正确细胞定位。用不同浓度的生物素孵育不同时间，得到最优生物素标记浓度和时间，之后用TurboID的PL-OxICAT方法定量检测了线粒体内半胱氨酸的氧化水平。为了检测ROS热点处的蛋白氧化水平，作者将目光转向了APEX酶，APEX可以利用过氧化氢实现蛋白质的生物素标记，作者假设在ROS热点处产生的过氧化氢足以激活APEX，从而实现对ROS热点附近的蛋白进行生物素标记，所以他们先将APEX2与线粒体定位蛋白进行融合表达，得到定位在线粒体基质的PDK1-V5-APEX2，定位在胞质中的cyto-APEX2，免疫荧光确定了融合蛋白定位的准确性之后，他们用外源性的过氧化氢和biotin-phenol检测了APEX2的生物素标记能力，发现可以在100 μM的biotin-phenol条件下就可以实现蛋白质的生物素标记。在标记验证实验中，作者用biotin-phenol先孵育细胞，然后用AMA（一种ETC抑制剂）诱导细胞产生ROS，发现在加入AMA之后，蛋白生物素化水平明显上升。
之后作者用基于APEX2的PL-OxICAT方法检测了线粒体中ROS热点处的蛋白质氧化水平，与之前TurboID得到的蛋白质组分析结果进行比较，发现APEX2富集得到的半胱氨酸位于线粒体中的ROS热点附近，而TurboID中得到的半胱氨酸是整个线粒体基质中的，matrix-APEX分析中鉴定的半胱氨酸比matrix-TID分析中鉴定的半胱氨酸显示出更高的氧化水平。而且作者还比较了用内源性过氧化氢和外源性过氧化氢处理时，APEX2标记到的线粒体内蛋白的不同。总之，作者将邻近标记技术与OxICAT技术联用，实现了线粒体内半胱氨酸氧化水平的定量分析。
本文作者：LZ
责任编辑：MB
原文链接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(23)00055-7
文章引用：DOI：10.1016/j.chembiol.2023.02.006
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