2021年1月，Benjamin Balluff团队在《Analytical Chemistry》上发表了一篇题为“Multilabel Per-Pixel Quantitation in Mass Spectrometry Imaging”的研究论文。提出了一种逐像素点MALDI定量质谱成像方法，通过添加多个标记物的方式，更好地评价组织间离子化效率差异的问题，适用于异质性生物组织样本的分析。

常规的质谱成像定量方法，是先将内标物质加到组织上，随后在相邻空白组织表面加入标准曲线工作液，经内标归一化后建立外部标准曲线。但是由于生物组织的异质性，外部校准与待测物在不同切片中的解析效率不同，且离子抑制效应与目标化合物的含量变化不成比例。因此，需要开发新的方法以提高QMSI的准确性。

1、样品处理

从猪肉中提取结肠组织，液氮速冻，−80°C保存。制备厚度为12μm的组织切片，室温干燥10min。随后对组织进行漂洗，抗原修复以及酶解。30°C条件下，将DHB基质混合液均匀喷涂至组织表面。

2、材料试剂

制备组蛋白H4肽(H-DNIQGITKPAIR-OH,m/z=1325.7535)的四种同位素标记形式。标记L1:H-DNIQGITKPAIR*-OH(Δm+10Da),m/z=1335.7618;标记L2:H-DNIQGITKPAI*R-OH(Δm+7Da),m/z=1332.7707;标记L3:H-DNI*QGI*TKPAI*R-OH(Δm+21Da),m/z=1346.8050;标记L4:H-DNIQGI*TKPAI*R*-OH(Δm+24Da),m/z=1349.7962。组蛋白H4肽的高分辨质谱检测结果如图1。

图1 组蛋白H4肽的高分辨质谱图

3、仪器参数

采用配备有MALDI源的Q-ExactiveOrbitrap质谱仪进行数据采集。正离子模式，空间分辨率为100 μm，质量范围为m/z1000−1500。光谱分辨率在m/z 400处设置为240,000 FWHM。组蛋白H4肽的MS/MS测量范围为m/z 100−1500，碰撞能量为35 eV，隔离窗口为0.5 Da，平均扫描25次。

4、标记物的添加与定量

四种标记物以5 % 乙腈溶解，浓度为5 pmol/µL。对于目标肽含量的检测，将L1、L2和L3以不同比例稀释后，在组织表面依次喷涂，使各层终浓度依次为73.2、18.3和4.6 fmol/mm²。随后喷涂 17.9 fmol/mm²的L4标记物，用于数据归一化。

5、数据处理

原始数据转化为imzML格式，导入至MATLAB。删除零值和TIC值前0.1%的像素点。在±15ppm的m/z范围内，根据最大离子强度，筛选组蛋白H4、标记L1、L2、L3和L4的信号。只有当上述信号同时被检出时，对该像素点进行线性回归。

1、组蛋白H4与四种标记物的特异性识别

为防止内源性分子信号对结果的影响，作者制备了未喷涂和喷涂同位素物质的组织切片，天际线光谱（Skyline spectra）显示，在标记物L1-L4的m/z处，不会出现内源性物质的干扰。如图2b-e。

图2 同位素标记组蛋白H4肽的特异性信号

2、组蛋白H4含量范围的测定

为了确保目标肽的强度始终在校准曲线的线性范围内，需预知组织中天然存在的H4组蛋白含量。作者将一系列浓度梯度的L1标记物点样在经胰蛋白酶消化的组织上，发现若选择浓度为62、15和3.8 fmol/mm²，即可实现完全覆盖H4肽在组织中的含量范围。如图2f。

3、多标记逐像素点定量

利用L1、L2、L3标记物的浓度区间，可针对每个像素点建立内部标准曲线。图3f表示坐标为(187,129)和(180,129)像素点的标曲。将各个拟合方程的斜率与截距可视化（图3g,h），可以观察到斜率在组织区域间存在差异，揭示了不同程度的区域性离子抑制效应。相反，截距的波动并不大，这表示理论上的最低检测浓度在组织间是一致的。随后，将检测到的H4信号强度分别代入单个像素的内部标准曲线中，计算绝对含量。拟合预测结果如图3i。

图3 组蛋白H4多肽的多标记法质谱定量

4、与单标记定量法的比较

作者进一步将该方法与之前报道的单标记定量法进行对比。在已喷有三种标记物的空白结肠组织切片上滴加L1标记物的系列浓度点，同样采用L4标记物的强度对结果进行归一化，建立7点外部校准曲线（图4a）。发现两种方法预测的中位数在相同的范围内（13-20 fmol/mm²），但多标记法覆盖的含量范围更广（图4e）。两种预测结果的比率图显示，差异主要出现在结肠粘膜，预测值高出两倍左右。

图4.单标记法与多标记法的比较 

5、单标记和多标记方法的交叉验证

为证实上述方法的可靠性，作者采用留一（leave-on-label-out fashion）和残差分析两种方式，计算预测浓度和理论浓度之间的比率。交叉验证表明，单标记法的准确性取决于目标化合物的浓度，其中高浓度被低估，低浓度被高估。相比之下，多标记法通过使用三个标记物来反应组织中目标化合物的含量变化，具有更高的准确度。如图5。

图5 单标记、双标记和三标记方法的交叉验证

6、基于LC-MS的多标记方法验证

取6份组织切片先进行MALDI-QMSI，再将其刮除并收集（图6a）。采用50% 乙腈和0.1% 三氟乙酸提取多肽，离心，脱盐处理后，进行UHPLC-MS分析。结果显示，建立的多标签法方法与液质定量方法相关性系数为0.87，具有较高的一致性（图6b）。

图6 多标记QMSI后LC-MS定量结果

本研究建立了一种基于多重标记的的定量质谱成像方法，通过对每个像素点建立内部标准曲线，能够更好地评价组织间离子化效率的差异。进一步地，通过交叉验证、LC/MS结果比对等方式证实了方法的可靠性，特别适用于在组织间含量范围跨度大的化合物定量分析。