分享一篇Nature communications上的文章，“ Off-the-shelf proximity biotinylation for interaction proteomics” ，本文的通讯作者是来自荷兰Radboud分子生命科学研究所的Michiel Vermeulen教授和他课题的Guido van Mierlo博士。该课题组的研究方向是基于定量质谱的相互作用蛋白的蛋白质组学和下一代 DNA 测序技术来破译干细胞中基因表达的遗传调控。
邻近生物素化标记技术最近成为一种研究相互作用蛋白质组学技术，可用于识别体内蛋白质之间的直接和间接相互。该技术通常使用基于质粒的表达或者基于CRISPR 的敲入策略，将邻近生物素化酶融合到目标蛋白质上。在添加外源生物素后，与诱饵蛋白邻近的蛋白质会被生物素化，随后通过定量质谱可以实现对邻近蛋白进行分析。目前各种邻近生物素化酶中，TurboID 是一种非常有吸引力的邻近生物素化工具，因为它是一种快速且无毒性的酶。然而其敲入策略，一方面复杂且耗时较长，另外一方面需要细胞本身能够适应这种敲入策略并长期繁殖，限制了其在原代细胞中的发展。因此，需要一种技术来克服这一瓶颈。
本文作者报道了一种称为 ProtA-Turbo 的重组邻近生物素化酶，其中蛋白 A 与大多数免疫球蛋白的Fc的重链特异性结合，实现了能够不通过基因手段的策略，对目标分子邻近蛋白的标记，最终通过质谱的方式可以实现鉴定。
首先，作者分别使用甲醛固定以及使用温和的去污剂毛地黄皂苷来改善细胞的通透性。通过使用针对内源性蛋白质或蛋白质修饰的抗体例如，Emerin、H3K9me3 和 BRG1，从而靶向目标分子，来验证该概念的可行性。ProtA-Turbo 酶可以通过蛋白 A定位到相应抗体的Fc的重链，在生物素的加入后，Turbo 酶会使得邻近的蛋白生物素化，结合后续的质谱流程，可以实现靶向目标富集的邻近标记。免疫荧光的结果显示，使用这些抗体的 ProtA-Turbo 介导的生物素化的结果与相应目标分子的已知核定位一致。例如，核膜中的 Emerin 抗体会在核边缘触发 ProtA-Turbo 介导的生物素化。
而质谱的结果显示，各组富集的生物素化蛋白中，包括许多已知的阳性蛋白。H3K9me3 抗体组中，甲基转移酶、各种已知的Reader蛋白以及着丝粒相关蛋白。在所有的实验结果中，最有趣的是，作者发现，其中FLYWCH1作为 H3K9me3 近端蛋白，与人类细胞中 H3K9me3 标记的（周围）着丝粒相互作用，并且与H3K9me3的甲基转移酶、已知的Reader蛋白有相互作用。
总而言之，ProtA-Turbo 酶是一种现成的邻近生物素化酶，可促进邻近生物素化在原代细胞中进行实验，可用于了解蛋白质在体内的作用。
本文作者：LSC
责任编辑：LYP
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25338-4.pdf
原文引用：DOI：10.1038/s41467-021-25338-4
目前评论：