分享一篇发表在JACS上的文章：Labeling Preferences of Diazirines with Protein Biomolecules，通讯作者是来自哈佛大学的Christina M. Woo教授，该课题组的研究重点是利用化学生物学方法来探索小分子对蛋白质功能的影响。
光亲和标记策略（photoaffinity labeling，PAL）是检测生物分子相互作用、蛋白质结构以及鉴定细胞中小分子靶标的关键方法。其中，diazirines是目前广泛用于检测生物分子相互作用的探针，但是对它标记模式偏好性的理解尚不够完全，使其实验设计和结果解析受到限制。这类探针在光解的过程当中，diazirines主要异构化为重氮中间体，该中间体进一步转化为卡宾以进行生物分子偶联，它会与附近的生物分子快速形成共价键，或者被水环境淬灭。但是，在PAL期间生成的重氮中间体可能会通过另外的“伪PAL”机制来驱动蛋白质标记，例如稳定的重氮化合物表现出与有机酸的优先反应性并与蛋白质酸性残基反应。因此，为了系统性地探索烷基（Alkyl-）和芳基（Aryl-）diazirines对于氨基酸和蛋白质标记偏好性，本文作者报道了两者与单个氨基酸，单个蛋白质以及在整个细胞蛋白质组中的标记偏好的系统评价。
首先，作者探究了Alkyl-diazirines和Aryl-diazirines与单个氨基酸的反应性。结果发现，Alkyl-diazirines能够更好地标记相对酸性的极性氨基酸。酸性残基与Alkyl-diazirines通过重氮中间体反应需要从酸中转移出质子到阳离子中间体，于是通过氨基酸水平（Glu，His，Tyr和Lys）的滴定实验和单蛋白水平（BSA）的In-gel fluorescence分析，发现Alkyl-diazirines标记是pH依赖的，主要通过重氮中间体进行标记。与烷基探针相比，对于Aryl-diazirines而言则是pH非依赖性的，主要是通过卡宾中间体进行标记。
pH依赖性表明电荷状态将在蛋白质底物的捕获中起重要作用，作者为了评估Alkyl-diazirines对细胞的标记效率，作者对具有净正、负或中性电荷的分布的探针（包括芳香族，核苷酸类似物，脂质和其他代谢物，共32个PAL探针）进行评价，结果发现带有净正电荷的探针显示出比中性或带负电荷探针更高的标记效率。此外，作者还发现了该PAL探针对膜蛋白具有富集倾向。为了进一步评价PAL探针在细胞中的标记的趋势，作者用探针标记SK-N-SH细胞蛋白质组，通过LC-MS/MS分析其标记的蛋白和位点，分析发现被标记的蛋白通常具有负静电区，其特征在于酸性残基较多或者pKa相对较高。化学蛋白质组学和结合位点数据表明，这些探针优先富集具有负静电表面的蛋白质或膜蛋白。
作者提出，这些数据有助于研究者使用Aryl-diazirines进行PAL实验设计。例如，只需更改探针分子的净总电荷，即可调整探针的设计以增强或减少蛋白质捕获。带中性或负电荷的探针可以选择性地观察到更强的结合，而带有净正电荷的探针可以捕获蛋白质组中更多的瞬时相互作用。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02509本文引用：DOI：10.1021/jacs.1c02509
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