分享一篇发表在ACS chemical biology上的文章，其标题是“Photoredox-Catalyzed Decarboxylative C-Terminal Differentiation for Bulk- and Single-Molecule Proteomics”。本文通讯作者是来自美国得克萨斯The University of Texas at Austin的Edward M. Marcottea和Eric V. Anslyn以及University of Kansas的Steven Bloom。
化学标记策略为蛋白质组学的发展和应用提供了极大的帮助，而开发肽段N/C端标记的技术则有可能进一步促进蛋白质测序的发展。相比于N端标记，目前C端标记技术仍受到酸性侧链丰度较高，C端的区域结构、修饰水平比较复杂等因素的限制。此前，传统的C端标记方法包括将C端和醋酸酐亲核加成为恶唑啉酮或者利用缩肽酶和亲和分子在高pH下的加成反应等。然而，这些方法都需要比较苛刻的标记环境或具有一定的不可控性，进而导致了一些敏感肽段蛋白质的丢失以及后续质谱分析的困难。近期有方法利用光氧化还原脱羧实现了肽段水平上的C端标记，而本文中，作者将其拓展到了TOP-DOWN蛋白质组学中，并探索其在肽段荧光测序中的应用。首先，他们利用单蛋白进行偶联环境的优化，包括进行光氧化还原时的装置、水相缓冲环境、催化剂、Michael受体和蛋白浓度等，最终实现60%左右的平均转化率。此外，作者系统地对比了20种不同C末端氨基酸的标记产率，结果发现大多数的氨基酸有75%以上的产率，即证明这一反应的普适性。末端Cys会因为发生共轭加成影响产率，需要提前通过烷基化进行保护，而色氨酸的转化率则可能因为吲哚环和催化剂之间的电子转移而降低。接下来，他们在Trypsin或者GluC消化后的BSA、酵母裂解液及人源细胞裂解液等复杂肽段上进行标记，证明标记有效且最高约为90%，并发现在复杂样品中除组氨酸和蛋氨酸以外的氨基酸都具有较高的标记效率。与此同时，标记后高置信度的谱图-肽段匹配数下降了，在排除了副反应的发生后，作者认为催化标记的条件可能导致一些肽段的丰度降低，所以后续还需要对催化剂进行优化。基于C端标记在复杂肽段样品中的无偏好性，作者试图探究其在单分子蛋白质测序中的应用潜力。此前作者开发过一种新型的荧光测序技术，将荧光团选择性标记在多肽的特定氨基酸上，并将多肽固定在载玻片上进行多轮Edman降解。通过检测每个多肽上荧光强度的损失来反映标记的氨基酸在序列中的位置，最终将荧光反应的相对位置映射到参考数据库中以确定可能的蛋白。在此，他们先将多肽C端标记上炔基，后用N端捕获策略将多肽固载，再通过酰胺偶联将荧光团加在谷氨酸上。释放肽之后，利用C端炔基将肽段固载到含叠氮的玻璃表面。进行荧光测序后，发现和对照组相比能够更好的反应谷氨酸在肽段中的位置，说明C端脱羧烷基化在荧光测序技术中的优势。总之，本文证明C端光催化脱羧烷基化标记能够和蛋白质组方法兼容，也能在肽段荧光测序中得到应用。文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00631DOI：https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00631
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