分享一篇发表在Chemical Science上的文章，标题为“Ultrasensitive detection of β-lactamase-associated drug-resistant bacteria using a novel mass-tagged probe-mediated cascaded signal amplification strategy”。文章的通讯作者是来自南京医科大学药学院的陈芸教授，其课题组的主要研究方向有：1）基于液质联用的定向蛋白质组学研究；2）基于特异性标志物的靶向药物制备和机理研究；3）大分子药物的药代动力学研究。

耐药细菌（DRB）的出现和传播始终是全球公共卫生及社会健康的最大威胁之一。有研究推测，未来DRB感染导致的死亡率将有可能超过由癌症导致的。有证据表明，早期和适当地防治DRB可以显著改善临床结果。因此，早期准确地诊断DRB的发生非常关键。

目前，抗菌敏感性测试（AST），例如纸片扩散法、肉汤稀释和E-test药敏实验等，是DRB检测的黄金标准。尽管AST提供了可靠的结果，但是依旧存在方法耗时，分析灵敏度和量化能力低下等问题。为了实现更好的灵敏度和定量能力，新检测方法的开发十分关键。

值得关注的是，β-内酰胺酶（BLA）是一种与大多数DRB密切相关的酶，实现对其的其快速检测对于规避对β-内酰胺类抗生素的耐药性至关重要。

图1. β-内酰胺酶的荧光探针/抑制剂及其在耐药细菌中的应用

Angew. Chem. Int. Ed., 2021,  60 , 24-40.

最近，由于其强大的定量能力，质谱法（MS）已成为分子检测不可或缺的工具，且基于MS的方法已被应用于实验室医学中的细菌检测。然而，感染早期患者的DRB菌落总含量可能远低于MS的检测极限（>10⁵个菌落形成单位(CFU)）。因此，在MS检测之前，通常需要漫长的培养浓缩步骤。幸运的是，在各种基于MS的方法中，依赖质量标记探针和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的方法可以将目标分子的信号转换为肽等质量标签信号，这显著扩展了MS的应用。此外，引入质量标记探针的同时可以采用信号放大策略将每个目标分子的信号转换为多个质量标签分子的信号。值得注意的是，检测DRB等超低丰度目标分子可能需要多种信号放大策略。

在本研究中，作者开发了一种质量标记探针（MP-CMSA）介导的酶和光辅助级联信号扩增策略，用于超灵敏检测β-内酰胺酶（BLA）。

首先，作者设计并合成了质量标记探针MP-CMSA。

在这项研究中，MP-CMSA探针需要发挥检测和信号放大这两种作用。为了实现这种双功能，探针需要具有两种功能结构，一种用于靶向识别，另一种用于检测。其中，7ACA被用作探针的识别部分。7ACA是β-内酰胺类抗生素的核心结构，很容易被BLA识别为底物并进行切割。而序列为AVLGDPFR的肽则是用于检测的质量标签。

图2. MP-CMSA探针制备及其介导的酶和光辅助级联信号放大的示意图，用于超灵敏检测BLA

对于探针的信号放大功能，目前已有多种策略。在这些策略中，树枝状大分子等高支化分子具有修饰容易、化学和物理稳定性好、制备简单等特点，受到了广泛关注。有证据表明，标记分子可以共轭在树状大分子的表面，实现指数级信号放大，信号放大的程度取决于树状大分子支化程度。MP-CMSA探针采用了第五代PAMAM末端128个氨基的树状大分子。

如图2所示，带有BLA可切除片段7ACA的BPEG-7ACA-N₃分子和带有光裂解片段PL的MP-PL-N₃分子均通过生物正交反应与DBCO修饰的PAMAM树状分子(PAMAM-DBCO)结合得到DM。然后，将多个DM固定在链霉菌亲和素琼脂糖珠上得到MP-CMSA探针。在BLA检测中，BLA可以裂解7ACA，导致DM从MP-CMSA探针上脱落。如果有足够的时间，每个BLA分子可以依次裂解多个7ACA片段，导致更多的DM脱落。然后，每个树突状分子在紫外光照下进一步释放质量标签，实现信号放大。因此，信号的级联放大实际上依赖于琼脂糖珠的负载能力和枝状大分子的分枝结构。

在对得到的DM分子进行表征后，作者对信号放大条件进行了优化，包括光裂解条件和酶促裂解条件。

图3. （A）MP-CMSA探针在不同紫外线暴露时间或黑暗中释放的质量标签的百分比;（B）MP-CMSA酶促信号扩增的评估

图4. PL的光裂解机理

（1）光裂解条件优化

从MP-CMSA探针中释放质量标签是检测中实现信号转换和放大的关键之一。光裂解反应提供了高效、可时空控制的化学键断裂。具体地说，这些反应可以在1小时内完成，大大提高了分析的通量。在本研究中，对紫外光敏感的邻硝基苯衍生物PL被用作连接片段。PL的光裂解机理如图4所示。

与此前的研究一致，如果质量标签共轭在PL的R1位置，并能在紫外光照后完全释放，那么质量标签就将是主要产物。此外，苯环上有两个烷氧基和一个硝基的PL在波长超过350 nm时能迅速降解，且对生物系统的危害较小。实验结果表明，优化的光解时间为40 min，此时MP-CMSA探针的质量标签几乎完全释放(图3A)。

（2）酶促裂解条件优化

BLA水解机理已有报道。在本研究中，首先，BLA与MP-CMSA探针中的7ACA结合。然后，BLA打开7ACA的β-内酰胺环，生成酰基酶中间体。这一过程导致化学重排和DM从琼脂糖珠上的探针中脱落。最后，水分子攻击酰基酶中间体，导致BLA重生，进入下一个酶裂解循环。如图3C所示，优化后的酶孵育时间为2 h。

在对信号放大条件进行优化后，作者验证了该探针的灵敏度和特异性，最后，对细菌感染患者的血液样本进行了检测。

实验中，共对26份样本进行了检测，同时采用了传统的AST测试进行对照。值得注意的是，MP-CMSA检测中出现了两个“模棱两可”的样品，其中一个在AST中为阳性，另一个为阴性。这种不一致值得未来进一步分析。此外，在65岁以上的患者中观察到更多的BLA相关DRB感染(61.1%，数据未显示)，证实老年患者更容易定植或感染BLA相关DRB。这种临床现象可能与这些患者的营养缺乏或免疫功能损害有关。

总的来说，本文开发了一种质量标记探针——MP-CMSA，该探针实现了酶促和光促级联信号放大，将BLA水平的信号转换为质量标签的信号。在这个探针的设计中，使用BLA底物作为识别部分，并使用肽作为质量标签。级联放大后，BLA的检测灵敏度可以有效地提高四个数量级，并且可以在血液样本中检测到低至50.0 fM 的BLA。结果还表明，老年患者更容易定植或感染与BLA相关的DRB。总体而言，质量标记探针介导的级联信号放大策略为促进DRB的敏感和快速诊断以及及时选择合适的治疗方案提供了一种潜在的方法。

本文作者：LD

原文链接：https://doi.org/10.1039/D2SC01530G

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