分享一篇发表在Chemical Science上的文章，文章的题目是“A photo-oxidation driven proximity labeling strategy enables profiling of mitochondrial proteome dynamics in living cells”，通讯作者是来自大连化物所的张丽华研究员。该课题组研究领域是蛋白质组学，致力于蛋白质组定量与定性方法的研究。作为细胞的动力源，线粒体在许多影响健康和疾病的关键过程中起着至关重要的作用，例如Ca2+稳态、炎症和细胞应激反应等，因此在蛋白质组学中被研究得最多。传统的线粒体蛋白质组学研究方法是通过密度梯度离心法获取线粒体，存在着时间长、纯度低、覆盖范围小等缺点。基于工程酶（例如APEX和TurboID）的邻近标记技术和基于细胞器可定位反应分子（ORM）的化学蛋白质组学技术的出现，为线粒体蛋白质组学分析提供了一个有效的工具。但是这些方法仍存在操作复杂、反应时间长、低时空分辨率以及产生额外的假阳性标记等缺点。为了获得高的特异性和分辨率，智能响应的化学反应物质被应用于标记亚细胞隔室中的蛋白质或其他生物大分子。反应基团的可控活化形成高反应中间体，这些中间体一般为自由基、激发单重态或高亲电片段，通过短的扩散半径和快速反应动力学，在很大程度上减少了假阳性，并且提高了时间分辨率。一对光响应探针(如光激活和光催化脱笼)和环境响应探针(如局域金属离子、H2O2和蛋白质聚合)被成功用于亚细胞蛋白质组分析。最近报道的基于生物正交和光催化脱笼邻近标记线粒体蛋白质组学策略（CAT-Prox）被用于线粒体蛋白质组分析，通过光敏的铱催化剂提高时空精确度，表明了光响应探针在亚细胞结构蛋白质组研究中的潜在优势。尤其是可见光催化剂（包括光敏蛋白miniSOG，过渡金属铱或钌光催化剂和有机光催化剂）可以产生活性物质用于捕获邻近蛋白质。由于其低生物干扰和高时空保真度，能够在其原环境中动态分析蛋白质，因此光催化策略有望用于探索线粒体蛋白质组的时空动态。1.TPP-DBF在体外和生理条件下产生单线态氧并标记蛋白 作者设计并合成了线粒体靶向光活化探针TPP-AcDBF(Scheme 1)，其中TPP为线粒体定位基团，DBF是光敏基团，在绿光照射下通过德克斯特能量转移可以产生充足的单线态氧（ФΔ=0.42）。单线态氧将蛋白质上的氨基酸残基氧化为亲电活性中间体，进而与炔丙基胺发生共价反应，最后通过click反应富集和鉴定。在本实验中，TPP-DBF在活细胞中被胞内酯酶水解产生活性。单线态氧(1O2)是线粒体蛋白激活和后续标记的首要条件。用单重态氧检测的线粒体可定位荧光探针Si-DMA评估TPP-DBF产生的1O2的含量，在氧化状态下，660 nm处的荧光强度大幅增加。在TPP-DBF存在下，Si-DMA的荧光强度随着绿光照射时间的增加而增加（图1A），其波长峰值约为510nm。此外，作者在活的HeLa细胞中发现了类似的现象，在绿光照射10分钟后，Si-DMA的荧光强度更强（图1B），这表明1O2的产生不受复杂细胞内基质的干扰，证实了TPP-DBF在体外和生理条件下产生单线态氧的能力。当这些蛋白被激活后，下一步就是对这些高活性蛋白进行标记。为了捕获氧化的氨基酸残基，通过在绿光照射下用DBF产生1O2，修饰含有潜在活性氨基酸残基（HMWY）的肽，将一组具有高亲核反应性基团(胺)和不同富集基团(炔基、生物素)的标记试剂用于蛋白质的标记和捕获。优化的标记试剂是提高线粒体蛋白标记效率的关键因素之一。根据MALDI-TOF/TOF-MS判断，炔丙胺（PA）显示出最高的效率，以组氨酸残基修饰的肽为最普遍的修饰位点，而含有其他氨基酸残基的肽（MWY）几乎没有显示修饰峰。在蛋白质水平，作者用LC-MS/MS在光氧化条件下分别检测4种试剂（PA、EA、BA、FcA）对牛血清白蛋白（BSA）的标记能力。除氧化修饰外，组氨酸残基中的PA修饰占10.4%，远高于其他标记试剂。PA脂肪族胺具有较高亲核性，其炔基具有较低的空间位阻，这使得PA能够有效地标记、氧化组氨酸残基。通过对标记位点的详细分析，发现BSA中17个组氨酸残基中的13个以及5个蛋氨酸残基的1个被标记(图1C)。将标记蛋白与叠氮生物素进行点击反应后，进行免疫印迹分析，探讨其标记机制和效果。如图1D所示，作者发现BSA的标记是在光激活探针TPP-DBF、PA和辐照都存在的前提下进行的，且标记强度随辐照时间和TPP-DBF浓度的增加而增强，提示了线粒体蛋白标记的可行性。此外，在没有TPP-DBF和绿光的情况下，BSA可以直接用1O2进行标记，这表明标记反应是通过1O2进行的，从而实现了对蛋白质标记的时空控制。2.TPP-AcDBF对活细胞中线粒体蛋白特异性地标记和捕获基于以上鉴定结果，作者通过光活化探针TPP-AcDBF的亚细胞分布和PA修饰来确定标记反应的选择性并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测光激活探针TPP-AcDBF的细胞通透性和亚细胞定位。结果显示，TPP-AcDBF的荧光与线粒体深红色荧光探针融合良好（图2A），表明其对自发靶向线粒体具有良好的特异性。鉴于TPP-AcDBF选择性地定位于线粒体，作者接下来以一种与罗丹明叠氮化物光激活的方式可视化PA标记，证实PA添加到蛋白质中的过程也发生在线粒体中。结果显示，在绿光照射下，细胞线粒体显示出强烈的绿色荧光，而在没有照射的情况下，罗丹明的荧光可忽略不计(图2B)。这表明PA加成反应具有光依赖性和高效的线粒体特异性。在与共轭生物素的点击反应后，通过免疫印迹分析对标记蛋白进行了相对定量，结果表明，与无绿光照射的对照组相比，在绿光照射的情况下，标记蛋白的强度明显增加，标记蛋白的富集明显增强。进一步证明了在活细胞中线粒体蛋白特异性地标记和捕获是可行的。接着，作者测定了TPP-AcDBF在裂解细胞内的最终浓度，发现它随着孵育时间和初始浓度的增加而增加。考虑到最终浓度和线粒体特异性，最佳孵育条件是用10 μM TPP-AcDBF孵育10 min, 此时HeLa细胞内浓度为177 μM(图2C)。它比TPP-AcDBF的初始浓度高18倍，因为亲脂性阳离子的自发聚集是由线粒体膜电位驱动的，因此在线粒体中浓度会更高。此外，在所有鉴定的蛋白质中，线粒体定位蛋白的比率为78%（图2D），这是在与生物素叠氮化物偶联物发生点击反应并在该培养条件下用链霉亲和素琼脂糖珠富集后，通过无标记MS定量分析评估的最高比率。这表明了光氧化驱动邻近标记策略用于分析亚细胞蛋白质的潜力。3.光氧化驱动的邻近标记策略具有良好的线粒体蛋白标记效果作者利用光氧化驱动的邻近标记策略，用高分辨率MS分析HeLa细胞的线粒体蛋白质组。PA标记的蛋白通过点击反应生物素化，用链霉亲和素琼脂糖珠富集，并用LC-MS/MS进行分析。最终鉴定了488个标记蛋白，其中310个蛋白明确定位于线粒体，对线粒体的特异性达到了64%（图3A）。亚线粒体分布表明，大部分鉴定的线粒体蛋白定位于基质和内膜(图3B)，符合亲脂性阳离子的基质靶向偏好，这可能为亚线粒体定位未知蛋白提供一些思路。在随后对已鉴定蛋白质进行的基因GO富集分析发现这些蛋白质参与了许多与线粒体密切相关的生物过程，例如翻译和能量代谢（图3C）。作者还在标记蛋白组中发现了核糖体、呼吸链复合体和内膜导入复合体的许多蛋白质亚基，它们在线粒体生物学中发挥着重要作用(图3D)。然而，标记的线粒体蛋白质组中仍有30-40%的非线粒体蛋白，这可能是光激活探针的随机扩散、生物素标记蛋白的反应效率相对较低以及样品内内源性生物素化蛋白干扰的结果。一方面，与APEX10或TurboID相比，作者的策略在线粒体蛋白的覆盖和特异性方面表现略差，可能是因为非生物催化过程的反应动力学低于工程酶。另一方面，与MRMs和CAT-Prox这两种具有代表性的无基因操作的线粒体化学蛋白质组学方法相比，该策略具有相似的特异性但更为全面。由于细胞环境复杂，不同的靶向分子会聚集在线粒体内不同的微区域中，从而产生不同类型的蛋白质标记。因此，有相当一部分不同的线粒体蛋白质仅通过光氧化驱动的邻近标记策略识别，这与其他方法在一定程度上是互补的(图3E)。此外，由于TPP-AcDBF能够高效地产生1O2且PA的位阻小，所以具有高反应性和良好的空间可及性，可以识别线粒体中丰度较低的蛋白(图3F)。。作者提出了一种光氧化驱动的邻近标记策略，利用具有光依赖性的线粒体靶向探针在无扰动状态下以高时空分辨率分析线粒体蛋白质组。在可见光的照射下，光控探针显示出优异的线粒体特异性和原位产生单线态氧的能力。该方法能够对不同细胞的线粒体蛋白进行标记和识别，并对脂多糖诱导的耐药和神经炎症过程中的线粒体进行蛋白质组动力学的研究。此外，有望改变线粒体靶向光激活探针的结构中的可定位部分和反应部分，使其实现对不同的细胞器的蛋白质组鉴定。原文链接：https://doi.org/10.1039/d2sc04087e
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