邻近标记技术在近十年来被广泛应用于鉴定特定细胞区域内的组成蛋白，尤其是那些很难通过传统生化方法分离的细胞区域，例如应激颗粒，线粒体外膜，神经元突触等。该技术依赖于具有邻近标记功能的工具酶，包括过氧化氢酶(e.g. APEX, HRP)和生物素连接酶(e.g. BioID, TurboID)等，在活细胞水平对邻近生物分子进行生物素标记1。虽然邻近标记技术成功实现了特定细胞区域内蛋白质的无差别大规模分析，然而在很多情况下，研究者希望关注到特定功能种类的蛋白质亚群。
近日，来自斯坦福大学的化学生物学家Alice Ting教授课题组在Nature Communications杂志上发表了题为“Spatiotemporally-resolved mapping of RNA binding proteinsvia functional proximity labeling reveals a mitochondrial mRNA anchor promotingstress recovery”的研究论文。该论文第一作者是Ting实验室的博士后秦为(北京大学王初课题组和陈兴课题组联合培养的2019年博士毕业生)。本工作是与Broad Institute of MIT and Harvard的Steven Carr课题组合作完成。
在本文中，作者首次提出了“功能性邻近标记(functional proximity labeling)”的概念：通过结合邻近标记技术和特定蛋白类型富集策略，实现对特定细胞区域内特定蛋白种类的大规模蛋白质组学分析。基于此，作者成功实现了对特定细胞区域内的磷酸化蛋白，O-GlcNAc修饰蛋白，以及RNA结合蛋白的富集与检测。其中，利用APEX标记的高时间分辨率(~1 min)和空间分辨率，作者成功检测到了ERK2蛋白在15min药物刺激下由磷酸化修饰介导的核转运过程。
RNA结合蛋白(RBP)是蛋白质组中非常庞大且重要的蛋白质类型，近年来发展的一系列RBP整体大规模分析技术已经成功挖掘了几千个RBPs。这些技术包括oligo(dT) beads捕捉技术，基于RNA代谢标记的富集技术(e.g. CARIC2)，以及基于相分离的富集技术(e.g. OOPS3)等。虽然这些整体分析技术提供了非常丰富的RBP数据库，但绝大部分RBPs的RNA结合功能还不太清楚，而具有时空分辨率的RBP分析新技术可以为研究这些未知功能的RBPs提供重要线索。
因此作者通过结合APEX邻近标记技术和基于相分离的RBP富集技术发展了“APEX-PS”策略，成功实现了特定细胞区域内RBPs的大规模分析。利用TMT多重定量蛋白质组学技术，作者首先鉴定到了791个细胞核内的RBPs。与之前发表的基于细胞核分离纯化的RBP数据集进行比较，作者发现APEX-PS具有很好的灵敏度和特异性。同时APEX-PS也鉴定到了一部分OOPS等整体分析技术未能覆盖的RBPs，而这些蛋白的丰度普遍较低，表明APEX-PS可以挖掘出局部区域的低丰度RBPs。另外，APEX-PS也具有分析RNA结合强弱的潜力。
APEX-PS更为重要的优势是研究那些很难通过生化方法分离的细胞器。因此作者进一步鉴定了细胞核仁内的RBPs，其中包括了大量经典的核仁内的RBPs，比如核糖体蛋白和snoRNP组成蛋白等等。另外在九个未知的核仁RBPs中，作者验证了MIS18A和ATAD5，发现它们的确具有RNA结合能力以及核仁定位。
在以上验证后，作者想利用APEX-PS进一步探索未知的生物学问题。而已知在超过1200个线粒体蛋白中，只有13个线粒体蛋白是通过线粒体DNA所编码，其余的蛋白则是由核基因组所编码，在细胞质内翻译合成后运送到线粒体中。但随着核糖体在线粒体外膜上被发现，以及最近的具有空间分辨率的RNA测序技术(比如Ting实验室的APEX-seq技术4)发现了线粒体外膜上也存在着大量的编码线粒体蛋白的mRNA，这些证据共同表明这些mRNA很有可能是在线粒体外膜上被翻译，然后快速地被运送进线粒体中。因此一个很重要的科学问题则是这些mRNA是如何被运送至线粒体外膜上，以及是否有线粒体外膜上的RBPs参与到该招募过程中？
因此作者进一步利用APEX-PS鉴定了线粒体外膜上的RBPs，以及它们在嘌呤霉素条件下的动态变化。嘌呤霉素可以有效地促进mRNA和核糖体的分离，因此在嘌呤霉素条件下鉴定到的RBPs的RNA结合能力应该不依赖于核糖体。在此基础上，作者成功鉴定了28个线粒体外膜上的RBPs，其中15个RBPs的RNA结合能力不受到嘌呤霉素的影响。作者挑选了5个RBPs进行验证，发现它们确实能够结合RNA，表明该数据集的准确性。
作者选择了SYNJ2BP来继续探索其RNA结合功能，因为它的RNA结合能力不受嘌呤霉素的影响，同时这个tail-anchor蛋白朝向细胞质的PDZ结构域具有潜在的RNA结合能力。作者首先通过RIP-seq技术鉴定了SYNJ2BP结合的mRNA，并通过CLIP技术进一步验证了11个编码线粒体蛋白的mRNA。利用APEX-seq技术，作者验证了这些mRNA确实存在于线粒体外膜且不受嘌呤霉素所影响。更为重要的是，在嘌呤霉素条件下，敲除SYNJ2BP可以显著降低五个mRNA靶标在线粒体外膜上的定位。这五个mRNA编码的蛋白包括了三个氧化磷酸化相关蛋白，一个线粒体核糖体蛋白MRPS17和一个线粒体分裂因子MTFP1。
基于此，作者猜想在嘌呤霉素以及其它细胞压力条件下，SYNJ2BP可以保护其mRNA靶标储存在线粒体外膜上，而在去除压力细胞恢复过程中，这些mRNA可以很快地被翻译并运送至线粒体内执行其重要功能。作者发现在细胞恢复过程中，敲除SYNJ2BP会显著延缓这五个mRNA靶标的蛋白合成速度。由于其中三个蛋白对氧化磷酸化复合物III和IV的功能非常重要，作者进一步研究发现SYNJ2BP敲除可以显著降低复合物III和IV在细胞恢复过程中的组装与活性，进而延缓细胞整体更新繁殖速率的恢复。因此，SYNJ2BP可以通过调控线粒体外膜上特定mRNA的翻译从而参与到细胞压力反馈过程中。
综上所述，功能性邻近标记技术可以实现对特定蛋白类型的大规模时空分析。基于此，在未来可以进一步发展针对不同蛋白类型的功能性邻近标记新版本，并应用于重要的生物学问题中。同时在技术层面上，二次富集策略在效率上还具有一定的不足，因此发展更为高效的甚至一步法功能性邻近标记技术会具有很大的应用前景。
原文引用：Qin W., et al. Spatiotemporally-resolved mapping ofRNA binding proteins via functional proximity labeling reveals a mitochondrialmRNA anchor promoting stress recovery. Nat. Commun. (2021)
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