给大家推荐一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，文章标题是Cell-surface Labeling via Bioorthogonal Host–Guest Chemistry。其通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学和生物化学系的Ellen M. Sletten教授。她的研究主要在于应用物理有机化学的基本原理，创造更好的纳米治疗和诊断方法，开发研究生命系统的新化学工具以及新型光收集材料。在本文中，作者提出了一种新的方法，利用分子间相互作用，来创建生物正交的主客体对，这种方法不依赖于活化的官能团和二阶速率常数，从而实现基于生物正交主客体化学的细胞标记。

化学生物学的进步产生了独特的方法来探测和操纵细胞中的生物分子，经典的化学生物学方法是生物正交化学方法。加入非天然代谢物，其上带有化学报告基团，然后选择性地与标记试剂发生共价化学反应。这种反应存在一个问题，二级反应速率常数和报告基团的稳定性存在负相关，即提高反应速率会导致报告基团的不稳定。而且，作为二级反应，通常需要较高浓度的标记试剂，但高浓度的试剂往往会导致高的背景信号。作者开发了一种生物正交络合方法，该方法基于主客体化学，具有一些优势，①反应速率快②不存在活化的功能基团从而避开了副反应③可逆性反应，可以对错误标记进行修改。

图1. 生命系统中生物分子标记的补充方法。

生物正交络合反应需要开发小客体参与的具有选择性的主客体对。作者以cucurbit[7]uril (CB[7])作为主体支架，通过点击化学方法将FITC荧光素连接上去，成功检测到了高亲和力客体（Ka≥10¹² M^-1）。但是低亲和力的客体具有较小的体积，可以提供更多的结合机会，因此，需要确定生物正交络合所需的最小的Ka。

选择了K_a范围为10⁶-10¹⁴ M^-1的CB[7]客体，以确定使用CB[7]-FITC实现显着性标记所需的最小K_a值和最低浓度。Jurkat细胞具有很高的唾液酸含量，因此可以通过高碘酸氧化产生醛基，再与氨氧基反应生成肟，从而将反应客体引入，最后用CB[7]-FITC进行标记。

结果发现，亲和力在10⁸-10¹⁴ M^-1的客体都表现出了优异的细胞标记效果，而亲和力为10⁶ M^-1的客体即使提高客体浓度，也没无法观察到显著的提高。因此，选择10⁸ M^-1作为K­_a的阈值。

图2. 确定细胞表面生物正交络合所需的最小Ka值。

在最小Ka值确定的过程中，还发现提高CB[7]-FITC的浓度，对标记效率并没有显著提高，而且客体在低摩尔浓度（nM级）也可以获得很好的标记效果，这比用于生物正交化学检测所需的浓度，低了2-3个数量级。

为了对两种方法进行比较，通过高碘酸氧化和肟连接，分别将一致数量的TMS客体和叠氮标签引入细胞表面，再分别用CB[7]-FITC和荧光素-BCN处理细胞。

结果发现，CB[7]-FITC标记具有优异的信噪比，而荧光素-BCN标记则并没有显著提高。进一步使用α-荧光素 IgG-CF640R偶联物来处理，生物正交化学的标记效果得到了提高，但其信噪比仍然低于生物正交络合方法。

图3. 生物正交络合和生物正交化学之间的比较研究。

虽然，使用肟连接可以比较两种方法的标记效果，但是，如果要将生物正交络合方法用于标记，客体必须可以被代谢摄入，而大多数客体在生理条件下是大分子或者阳离子，其摄入存在困难。

邻碳硼烷是CB[7]的一种中等亲和力的中性客体，将其与9-氨基唾液酸反应，再使BJAB K20细胞（工程化的低唾液酸细胞）摄入得到的偶联物，最后用CB[7]-FITC标记。由于该细胞系需要较高的CB[7]-FITC浓度，以及邻碳硼烷的Ka相对较低，产生了更高的背景信号，但也成功证明了邻碳硼烷作为生物正交络合反应客体的可行性。

图4. CB[7]客体的代谢结合和通过生物正交络合进行标记。

综上所述，作者开发了一种生物正交络合方法，作为生物正交化学方法的补充。这种方法依赖于热力学而非动力学，并确定了反应实现所需的最小Ka值（≥10⁸ M^-1）。与生物正交化学方法相比，生物正交络合使用较低浓度的标记试剂，从而具有更高的信噪比和更低的共价背景信号。

文章作者：CXY

DOI：10.1021/acschembio.1c00494

责任编辑：LD