分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，通讯作者是纽约州立大学的Qishan Lin和Jia Sheng教授，他们致力于使用色谱-质谱研究RNA、蛋白质组及代谢组学相关问题。
在细菌和古菌DNA中发现广泛存在的硫代磷酸酯(PS)修饰，是由Dnd基因簇介导的遗传学修饰。硫原子取代磷酸二酯键的一个非桥接氧，并特异性地以Rp构象存在，丰度约为4-31个/104个核苷酸。研究表明该种修饰是细菌的保护机制，可以增强DNA的稳定性，保护DNA免受部分核酸酶的降解，且与细胞的氧化应激有关，故被广泛用于基因治疗等领域以提高核酸的稳定性。
但截至目前该种修饰仅在原核细胞的DNA中观察到，作者希望使用生物质谱来发掘原核及真核细胞的RNA上是否也存在PS修饰。首先确定了使用混合核酸酶消解细胞的最佳反应条件，然后以DDTT为硫化剂，在核苷酸合成仪上合成了纯的Rp构型GpsG。以此为基准测定31P NMR和LC-MS/MS(ESI)图谱，再与从细胞消解物中提取的RNA的UPLC-MS检测结果相比对，发现在大肠杆菌、乳酸菌、小鼠肝组织、黑腹果蝇模式细胞、Hela细胞等都观察到了RNA的PS修饰，且与DNA的PS修饰一样，以序列特异性的形式存在，主要是GpsG-Rp，且不能被混合核酸酶降解，以二核苷酸的形式被分离出来。
在原核及真核细胞中都观察到RNA的PS修饰后，作者希望挖掘调控这一过程的酶。通过生物信息学的方法，发现调控原核DNA PS修饰的DndA基因与真核细胞依赖磷酸吡哆醛的半胱氨酸脱硫酶IscS/NifS具有很高同源性。于是作者推测该基因很可能也调控了RNA的PS修饰。于是作者通过生物信息学的搜索筛选，选出大肠杆菌的pML300菌株作为研究对象。通过基于λ噬菌体的Red同源重组技术将DndA基因替换为氨苄青霉素抗性基因，发现GpsG修饰随即下降一半，这表明DndA基因确实与RNA的PS修饰有关，但其它酶如半胱氨酸脱硫酶等也参与其中。随后，作者使用转录组rRNA分离试剂盒，将大肠杆菌、乳酸菌和HeLa细胞总RNA中的rRNA分离出来，进行LC-MS/MS检测，发现GpsG修饰几乎全部存在于rRNA上。
总之，作者通过质谱和生物信息学方法，首次鉴定了原核和真核生物RNA上的硫代磷酸酯修饰，扩大了核酸天然修饰文库，这也是150多种RNA修饰中首个发生在磷酸基团上的修饰。该修饰以Rp-立体特异性和GpsG、GpsC、CpsA-序列特异性出现在rRNA上，其他类型的RNA似乎较少存在该种修饰。RNA的PS修饰的具体功能、调节酶及酶作用机制、在基因治疗中的应用、以及更复杂的PS-碱基/核糖双修饰的存在与否，还有待化学生物学和生物信息学的进一步研究。
本文作者：WFZ
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.0c00163
原文引用：DOI: 10.1021/acschembio.0c00163
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