蛋白质选择性修饰策略的开发是生物化学中一个很重要的挑战，尤其是新型小分子-蛋白质偶联物药物的出现激发了大量的小分子对天然蛋白质进行化学选择性功能修饰新方法的产生。传统的生物偶联策略主要利用蛋白质中具有亲核性的氨基酸残基（如赖氨酸与半胱氨酸）与亲电试剂的共价偶联来进行。但是，氨基酸残基的多重反应性使得具有选择性的特异性修饰充满了挑战。鉴于亲核性蛋白修饰策略的复杂性，人们期望在温和条件下实现对复杂生物大分子的选择性功能化。

美国普林斯顿大学David W. C. MacMillan课题组对光催化反应有着深入的研究。近日，该课题组利用光催化反应对蛋白质分子上的甲硫氨酸残基进行选择性修饰，其成果发表在J. Am. Chem. Soc.（DOI: 10.1021/jacs.0c09926）上。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者设想通过激发态下的光催化剂对硫原子进行单电子氧化，还原的光催化剂自由基阴离子可以作为碱，使硫自由基阳离子去质子化，从而生成所需的α-硫自由基，进而实现在甲硫氨酸上进行选择性修饰。作者以四肽VMFP为模型分子，在水溶液中对光催化剂进行筛选（Figure 2a）。结果显示，光黄素（lumiflavin）能够以79%转化率催化甲硫氨酸与Michael受体进行偶联，并且反应几乎没有副产物的产生。作者对反应的机理进行了推测（Figure 2b）：激发态下的光黄素能够与硫醚发生单电子转移（SET），被还原后的光黄素负离子自由基能够脱除硫自由基邻位甲基的质子，从而促进了α-自由基的形成。该自由基能够与Michael受体发生加成反应，其产物能够与氢化的催化剂发生氢原子转移（HAT），重新生成催化剂，从而完成催化循环。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

随后，作者在模型蛋白Aprotinin上对Michael受体进行了筛选（Table 1），该蛋白上只有一个甲硫氨酸残基可供修饰。在对条件进行优化后，多种受体都能够以中等以上的产率与蛋白质进行偶联（2, 13-19），并且蛋白质侧链的羧基与氨基不会影响反应。对于部分Michael受体（13-17），反应得到了单烷基化产物、双烷基化产物和三烷基化产物的混合物，即Michael受体能对底物进行多重修饰，其原因在于α-硫自由基在催化循环中的再次生成。利用该方法，作者成功地向蛋白质中引入了多种功能性的官能团。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

接下来，作者在不同分子量的蛋白质底物上实现了对甲硫氨酸的标记（Figure 3）。一般情况下，甲硫氨酸的标记程度与其在溶剂中的暴露程度密切相关。对于含有多个甲硫氨酸残基的蛋白质，表面暴露的甲硫氨酸残基的标记程度明显大于内部未暴露部分（22-23）。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者评估了该光催化反应与是否能够在温和的条件下修饰蛋白质而不改变其三级结构（Figure 4）。作者对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）所含有的甲硫氨酸残基实现了选择性修饰，向其中引入了炔基官能团，并通过后续的点击化学反应定点引入生物素和聚精氨酸等功能性官能团。修饰前后蛋白质的荧光强度并没有明显的变化，意味着这种修饰方法对荧光蛋白的结构不会造成显著的影响。这一结果也突出了光催化生物修饰的能力，使甲硫氨酸能够快速进行选择性修饰并将能有效输送到细胞中。

（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

小结：

作者利用光催化剂成功地实现了蛋白质上甲硫氨酸残基的选择性修饰，异于传统的亲核性氨基酸残基与亲电试剂发生共价偶联反应。该方法特异性好、条件温和，可实现对各种蛋白质的修饰。该反应在合成新型的蛋白质偶联物以及功能性分子上将表现出广阔的应用前景。