位置特异性标记是在核苷酸分辨率或更高水平上探索和设计RNAs的迫切需要。目前，大多数RNA标记的位置特异性策略都是后合成的，其中合成和标记是分开的。这两个过程的实验条件，包括缓冲液、酶、温度和程序，都需要分别进行优化。分离的合成和修饰增加了RNA降解和变性的风险。此外，RNA在合成后会折叠，这使得标记某些位点的效率低下，甚至不可能。RAIL和TRAIL考虑到这个问题，并将DNA杂交到所有位点，但那些被选择用于酰化的位点除外；然而，在与暴露的目标位点相邻的位点可能会发生本不期望的修改。与合成后标记不同，共合成标记在合成过程中将修饰引入RNAs。通常，共合成方法在选择标记位点时具有更大的灵活性，最大限度地减少对RNA结构或功能的干扰，并减轻共合成标记中的降解。固相化学合成是合成标记RNAs最广泛使用的方法，但这种方法不适用于大于100 nt的RNAs。通过在DNA模板上转录TPT3，扩展的遗传字母转录被用于将非自然碱基NaM引入长RNA。然而，TPT3和NaM在商业上并不可用，它们复杂的化学合成阻碍了这种标记方法在非专业实验室的使用。在RNA的位置选择性标记（PLOR）中，对转录暂停和恢复的精确控制能够将修饰引入RNA的特定位点。PLOR在位置特异性标记方面显示出巨大的潜力，并且PLOR中使用的所有试剂都是商用的，并且对于非专业实验室来说是友好的。然而，PLOR有其局限性。首先，PLOR分为起始、延长和/或终止阶段。起始阶段有特定的要求。例如，它的最佳长度在10到20 nt之间，序列太长或太短都可能导致效率低下或失败。其次，PLOR不能选择性地标记连续相同核苷酸区域中的一个位点。第三，每延长一个周期，PLOR的效率降低约10%，因此，多个延长周期的产量预计会很低。

近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室刘昱课题组在著名学术期刊《Journal of the American Chemical Society》上发表题为“Short Oligonucleotides Facilitate Co-transcriptional Labeling of RNA at Specific Positions”的研究论文，他们研发了一种RNA共转录-位点特异性标记的新方法—SMRITI。该方法为RNA的位置特异性标记提供了一种高效和新颖的策略，具有极大的灵活性，包括在同一类型的连续核苷酸的中心位点。在SMRITI中使用功能化延伸复合物减少了对RNA序列的需求，允许以高产量进行时间效率高的RNA标记，并且绕过了对启动子的需要，从而防止重新起始以提高产品纯度。此外，SMRITI的简单性使其可用于RNA相关领域。作者通过在不同的RNA中引入荧光团、核苷酸类似物和所需位置的自然修饰，证明了SMRITI的能力。这种方法可以很容易地扩展到包含其他修饰核苷酸，例如带有修饰核糖的核苷酸，以增强用于疾病治疗的标记RNA药物的稳定性。

图1. SMRITI合成特定位置标记RNA示意图。EEC由DNA模板（灰色带）、非模板（灰色带）、LRNA（黑线）、短辅助DNA（橙色线）和RNAP（黄色球）组装而成。EEC的一个显著特征是，模板和非模板DNA是双链的，除了未配对的空泡（黑色带），这允许LRNA与空泡中的DNA模板杂交。辅助DNA被设计为与LRNA上游3′端互补，以破坏LRNA的折叠并确保末端的释放，从而显著提高EEC的组装效率。EEC的另一个显著特点是混合固体−液相，通过将生物素附着的DNA固定在涂有链霉亲和素的珠子上实现。这允许通过暂停来延长LRNA−重新启动模式，并在特定位置启用RNA标记。按照图1中的蓝色箭头进行一轮SMRITI反应。在添加不到四种类型的NTP（包含标记的NTP）的情况下，RNAP将带有标签（黄色星形）的LRNA末端延长10分钟，并在需要缺失NTP的第一个位置暂停。在大量的磁珠和SPE（固相萃取）后，通过添加含有缺失NTP的新NTP混合物重新开始延伸。通过这种方式，不同的NTP（少于四种类型）可以反复暂停和重新启动延伸，以根据需要在特定位置加入经过修饰的NTP。一旦转录延伸到选择标记的位置之外，就会添加一个完整的NTP集（四种类型的NTP）来转录全长RNA，而无需人工暂停。

图2. SMRITI合成PRF的实验优化。（A） PRF的二级结构，包含LRNA（灰色突出显示）和新生转录本（黄色突出显示）。FRET对、Cy3和Cy5显示为绿色和红色荧光。在91AP-和93AP-PRF样本中，位点91和93处的A核苷酸分别被2AP替换。（B）不同条件下PRF合成效率的比较：无辅助DNA的SMRITI合成（通道1）、有辅助DNA的SMRITI合成（通道2）和PLOR合成（通道3）。在SMRITI合成中，通过辅助DNA观察到延伸的LRNA。（C）各种条件下PRF合成效率的比较：空泡长度−LRNA杂交（灰色条带）、空泡长度（紫色条带）和LRNA自由尾长度（橙色条带）。对于PRF的合成，全长RNA仅在辅助DNA存在的情况下出现（图2A、B）。作者测试了不同的辅助DNA从LRNA释放一个0 - 15 nt的末端，并且一个6 - 15 nt的自由端是组装带有9 nt空泡的EEC的最佳选择（图2C）。在作者的设计中，RNA末端只有8个nt与空泡互补。因此，6−15 nt自由端可以形成一个6−8 bp RNA-空泡杂交。RNA-空泡杂交的最佳大小通过改变空泡区域内的序列进一步确定。当RNA含量增加时，SMRITI的产量随着杂交长度的增加而增加当RNA-空泡杂交是4−8 bp时，与早期观察结果一致（灰色和橙色条，图2C）。杂交长度越长，EEC越稳定。然而，9 bp杂交的效率是一种很低的过程模式，这可能是因为RNA和空泡之间的完全互补性造成的空间位阻。空泡大小也影响SMRITI。使用12 nt空泡的SMRITI产量明显低于9或10 nt空泡（图2C）。

图3. SMRITI生成的修饰PRF在稳态荧光和smFRET研究中的应用。（A） 未标记的91AP-、93AP-和Cy3Cy5-PRF在UV下的PAGE图像，表明成功合成了具有双荧光团的Cy3Cy5-PRF。在添加Mg²⁺后，观察到91AP-PRF和93AP-PRF的相反荧光变化（图3B）。91AP-PRF的荧光随着2 mM Mg²⁺的增加而增加（红色曲线，图3B），表明该部位发生了结构变化，导致2AP更多地暴露在溶剂中。纯化的Cy3Cy5-PRF与13-nt生物素-DNA杂交，并固定在石英表面进行smFRET研究（图3C）。在没有Mg²⁺的情况下，用Cy3Cy5-PRF进行的smFRET测量产生了一个折射率示波图（图3D），该示波图被拟合成两个高斯峰，一个低FRET峰（EFRET∼ 0.2)和一个高FRET峰（EFRET∼ 0.8)。这表明，在没有Mg²⁺的情况下，至少存在两种具有明显假结相互作用的构象。大约68%的PRF处于高FRET构象，与晶体结构中假结的形成相一致。添加2 mM Mg²⁺产生了显著更高的高FRET构象群体（图3D）。作者观察到一个Cy3Cy5-PRF分子，以进一步识别SMRITI标记的PRF，不仅确认供体和受体被整合到一个分子中，而且还发现，在添加Mg²⁺后，RNA的动态性更低（图3E）。因此，动力学的降低清楚地表明Mg²⁺有助于PRF中假结的形成和稳定性。

图4. SMRITI将天然修饰的核苷酸并入核糖A内环。图4A中的灰色和黄色突出显示的序列代表SMRITI中的LRNA和新生转录本。位点38、39和40均位于核糖A的结合囊中，位点39通过形成氢键直接与腺嘌呤相互作用。在图4B中，添加U和m⁵C、U和C或U（不含C）分别产生38 nt m⁵C（用m⁵C修饰的38 nt RNA，泳道1）、38 nt RNA（泳道2）或37 nt RNA（泳道3）。在泳道1和泳道2中观察到类似的RNA产量，表明转录m⁵C和C的T7 RNAP在SMRITI中的活性相当（图4B，C）。基于在泳道4、5和6中也观察到较短的RNA片段（38 nt），作者提出T7 RNAP将这些修饰的UTP，尤其是mo⁵U，整合到RNA中的能力低于未修饰的U（泳道4和7）。加入m1ψ和ψ的产率略低于未改性UTP的产率（图4C）。m⁶A的掺入量与未经修饰的A相当；然而，在SMRITI中，m¹A几乎没有被T7 RNAP整合到RNA中，这可能是因为N1处的甲基破坏了A和T之间的氢键（泳道9−12，图4B）。结果表明，通过SMRITI将ψ、m¹ψ、mo⁵U、m⁵C和m⁶A准确地整合到RNA中，并且将m⁶A和m⁵C引入RNA的效率与它们的天然对应物相当，并且高于m¹ψ、ψ和mo⁵U（图4C）。

图5. 核糖A在各种自然修饰下的停-流动力学。在25°C下，与天然或改性核糖A样品混合后，2AP的荧光降低，改性样品引起的2AP荧光变化比天然RNA弱。这表明修饰后的核糖开关RNA仍然可以感知配体，尽管修饰确实会损害RNA的结合囊。在25°C下，ψ和m¹ψ对RNA的配体结合的破坏最小，而配体结合受m⁵C掺入的影响最大。图5E显示了WT和改性核糖A在25至52°C温度下的动力学速率，m⁵C对2AP的响应比WT更快，尽管前者在25°C时产生的荧光变化小得多。除m¹ψ-核糖A和ψ核糖A外，WT和改性核糖A之间的差异随着温度的升高而更显著（图5C、D）。

图6. 通过SMRITI对相同核苷酸进行内部标记。（A） 核糖A的二级结构。连续尿苷核苷酸UUU以红色显示。中间U上的荧光团Cy3显示为绿色荧光。用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离含有0、1或2个Cy3基团的核糖A样品，在实验条件下，疏水的Cy3使RNAs在C8色谱柱上的保留时间延迟了约2分钟。作者进行了逆转录（RT）实验来确定修饰位点的位置，并在RT实验中使用FAM标记的DNA引物来检测次要产物。大多数36Cy3-核糖A作为核糖A反转录到全长DNA产物中（图6C），而36Cy3-核糖A检测到截短的RT产物（绿色星号，图6C）。Cy3对逆转录酶的抑制作用不是很显著，可能是因为修饰位于36Cy3核糖A中的碱基而不是核糖，导致逆转录酶不完全在标记位点停滞，而是在标记位点下游1 nt处停滞。当在RT反应中使用36Cy3-和37Cy3-核糖A作为模板时，检测到截短的RT产物，长度差异为1 nt。这一观察结果表明，SMRITI可以精确标记RNA中连续核苷酸中的一个选择位点。36Cy3-、37Cy3-和3637Cy3-核糖A的光物理性质由稳态荧光光谱表征，所有标记核糖A物种的荧光随着配体腺嘌呤的加入而降低。U36的翻转可能会使与36或37共价连接的Cy3去堆叠，导致添加腺嘌呤后荧光降低（图6D、E）。这与报道的结果相符，即与核酸相连的Cy3的堆积可以增强荧光。令人惊讶的是，双标记样本3637Cy3核糖A对配体的反应不如单标记样本敏感。可能是因为相互作用，例如，两种Cy3染料的堆积抵消了U36翻转引起的去堆积效应，导致添加腺嘌呤后3637Cy3核糖的荧光变化可以忽略不计（图6F）。

图7.使用FRET对合成核糖C（>200 nt）的三种策略（SMRITI、PLOR和PLOR与SMRITI的耦合）。（A） SMRITI、PLOR或PLOR与SMRITI偶联合成Cy3Cy5核糖的示意图，使用SMRITI的试验持续时间和产量显著提高。（B） Cy3Cy5核糖体的PAGE和HPLC表征。在530 nm（左）和620 nm（右）处激发的Cy3Cy5核糖的荧光页面图像。在550 nm（绿色）和650 nm（红色）激发下Cy3Cy5核糖的HPLC曲线。（C） 在不存在或存在100μM配体（中间和底部）的情况下，含有0 mM Mg²⁺（顶部）和2 mM Mg²⁺的Cy3Cy5核糖体的smFRET概率直方图。（D） 在没有或存在100 μM配体的情况下，Cy3Cy5-riboC的单分子FRET轨迹为0 ~ 2 mM Mg²⁺。在没有Mg²⁺的情况下，只有低FRET(∼0.25），表明没有KL。2 mM Mg2+的加入使分子由低(~ 0.25)态跃至高(~ 0.6)态(图7C)，表明KL在L5 ~ L13之间是动态形成的。Mg²⁺（2 mM）和AdoCbl（100μM）都显著增加了高FRET状态的比例，Mg²⁺增强了两种FRET状态之间的动力学，AdoCbl稳定了RNA构象，这对于核糖C响应AdoCbl切换功能至关重要。

合成具有位置特异性标记的RNA的能力对于RNA的研究和应用非常重要。然而，这种RNA的合成仍然是一个挑战，尤其是对于长度超过200 nt的RNA。在这项工作中，作者开发了新的方法SMRITI，它为RNA的位置特异性标记提供了一种高效和新颖的策略，具有极大的灵活性，包括在同一类型的连续核苷酸的中心位点。在SMRITI中使用功能化延伸复合物避免了起始阶段，减少了对RNA序列的需求，允许以高产量进行时间效率高的RNA标记，并且绕过了对启动子的需要，从而防止重新起始以提高产品纯度。此外，SMRITI的简单性应使其可用于RNA相关领域。作者通过在不同的RNA中引入荧光团、核苷酸类似物和所需位置的自然修饰，证明了SMRITI的能力。这种方法可以很容易地扩展到包含其他修饰核苷酸，例如带有修饰核糖的核苷酸，以增强用于疾病治疗的标记RNA药物的稳定性。

DOI: 10.1021/jacs.2c00020

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00020

刘昱

北京师范大学化学专业学士，美国韦恩州立大学分析化学博士，美国国立卫生研究院博士后。现任上海交通大学特别研究员，博士生导师。主要从事RNA研究，开发PLOR方法合成位点选择性标记的RNA，以核磁共振 (NMR)、X-射线自由电子激光技术 (XFEL)、X-射线晶体衍射、单分子荧光转移技术 (smFRET)、小角散射技术 (SAXS) 等为主要手段解析非编码RNA的三维结构，结合生物化学、合成生物学及分子生物学等手段阐明核糖开关RNA调控基因表达及艾滋病毒RNA与蛋白质相互作用机理的分子机制。相关研究已发表于Nature，Cell，Methods等国际期刊上。

编辑：杨丽娟

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