生物分子间的弱相互作用在许多细胞功能中发挥着重要的作用。但通过这种弱相互作用形成的分子复合物寿命较短，难以进行研究。光学单分子检测方法具有实时监测分子间相互作用和捕捉瞬态事件的独特能力。然而，为了达到足够低的背景，以便通过荧光检测单个分子事件，荧光分子的浓度不能太高。这种低浓度要求严重阻碍了解离常数较大的相互作用的单分子研究。

近期，普林斯顿大学的Haw Yang团队设计了一种基于链霉亲和素诱导的邻近方法（SIP），显著提高了分子的有效浓度及相互作用的概率，并与单分子荧光共振能量转移技术相结合，为弱相互作用和瞬态相互作用的研究提供了有力的途径。该工作发表在J. Am. Chem. Soc.上，题为Amplifying Intermolecular Events by Streptavidin-Induced Proximity。

作者首先通过DNA杂交验证了该方法的可行性。其中，两条DNA链的3'端分别用供体基团Cy3B和受体基团QSY9标记，用于FRET检测；5'端则均用生物素标记。Cy3B标记的DNA链被称为探针链（图1a），QSY9标记的互补DNA链被称为Target-8（图1b），QSY9标记的非互补DNA链被称为Target-R（图1c）。

作者先展示了SIP在整体水平上对分子相互作用的增强。如图1所示，当探针与Target-8混合时，供体发射没有变化，表明在该浓度下几乎没有形成双链体；在添加相同浓度的链霉亲和素后，供体荧光强度显著降低，表明分子间相互作用确实是通过链霉亲和素诱导邻近促进的；而当使用非互补目标链Target-R作为对照进行相同的测试时，无论是否存在链霉亲和素，荧光都没有表现出明显的变化，证明了生物素化的DNA链和链霉亲和素的混合物不会在DNA链之间引入可检测的非特异性相互作用。

图1 SIP对分子间相互作用的增强

然后，作者在单分子水平上对DNA杂交进行了检测。DNA链的结合（低信号强度）与解离（高信号强度）事件可以直接可视化，并进行定量表征。在该实验中，链霉亲和素被固定在聚乙二醇（PEG）修饰的盖玻片表面。当加入探针链与非互补的Target-R时，没有观察到强度变化（图2b）；当使用未生物素化的自由Target-8链时，结合事件频率较低（图2c）；而当使用生物素化的Target-8链时，结合事件明显增加（图2d）。如图2e、f所示，SIP提高了结合事件频率和结合时间。

图2 SIP用于单分子检测

接下来，作者验证了SIP方法对多种结合态的检测能力。作者设计了一个带有发夹和两个与探针链互补的重叠序列的目标链Target-H（图3a），可以形成两种不同的杂交状态（图3e），进而在FRET中产生两种荧光强度状态。当使用未生物素化的自由Target-H链时，两种结合状态的事件频率较低（图3b）；而当使用生物素化的Target-H链时，两种结合状态的事件频率明显提高（图3c）。

图3 Target-H的单分子实验

接下来，作者使用SIP研究了Cas9和非同源DNA底物之间的相互作用。CRISPR-Cas9系统在基因组工程中具有广泛的应用。Cas9是一种RNA引导的核酸内切酶，可通过DNA中的三核苷酸原型间隔区相邻基序（PAM）识别 DNA 底物，Cas9-RNA复合物从PAM开始，利用RNA-DNA碱基配对破坏目标dsDNA，从而触发Cas9的催化切割。与靶标结合相比，Cas9-RNA复合物与DNA的脱靶结合表现出低得多的亲和力。因此，当亲和力相对较低时，脱靶结合的检测和生物物理表征具有挑战性。

作者通过SIP方法检测了Cas9-RNA复合物的脱靶结合。如图4a所示，Cy3和QSY9被分别标记在DNA和引导RNA（gRNA）的一端，另一端则被生物素修饰。作者设计了三种DNA底物（图4d）：同源 DNA，具有一个PAM 和与gRNA互补的20 bp序列，记为DNA-cog；与gRNA 完全不互补的错配DNA，记为DNA-mm；缺少PAM的DNA，记为DNA-nop。

图4 SIP在Cas9系统中的应用

如图5所示，当使用DNA-cog时，表现出稳定的结合事件；而当使用DNA-mm和DNA-nop，则表现为短暂的结合、解离事件。经计算，DNA-nop的解离速率和结合速率快于DNA-mm，验证了DNA:Cas9-RNA 结合亲和力对PAM中的突变更敏感的结论。

图5 Cas-RNA与不同DNA底物的结合

总的来说，本文通过链霉亲和素诱导邻近的方法实现了分子间弱相互作用力的研究，在显著增加有效浓度的同时保持了明确的局部化学计量。

陈佳璐

黄硕课题组2021级直博生