本周分享一篇发表在JACS上的文章，Chemical Proteomics Approach for Profiling the NAD Interactome，其通讯作者是来自俄勒冈健康与科学大学的Michael S. Cohen教授，专注于PARP蛋白相关的研究。

      NAD⁺/NADH是生物体内重要的小分子，不仅担任着氧化还原酶辅酶的角色，还以消耗性物质（往往伴随着烟酰胺糖苷键的断裂）作为许多酶的底物，如聚ADP-核糖聚合酶（PAPR）和沉默调节蛋白（SIRT），介导翻译后修饰等一系列重要的生命化学过程。近期的研究表明，一些非经典的以NAD⁺为底物的酶中的结合位点与经典的保守结构完全不同，此外，NADH也是许多蛋白的别构调节剂。为了找寻一种无偏的化学蛋白质组学方法，作者希望基于光亲和标记（photoaffinity labeling, PAL）开发新型的NAD探针并进行化学蛋白质组学的研究。

      PAL探针包含两个反应活性的位点：1）末端的click位点；2）光交联的活性位点。作者设计的warhead包含一个末端的炔基以及一个重氮基团用于光交联，并将warhead连接至NAD腺嘌呤环的C-2或N-6位（2-ad or 6-ad）。同时，作者还将与核糖相连的烟酰胺替换为苯甲酰胺（benzamide adenine dinucleotide, BAD），使得原先烟酰胺糖苷键的位置无法被酶进行切割。

      作者首先用2-ad-BAD与6-ad-BAD处理PARP蛋白，并测试了其酶活，其表现与不带warhead的BAD一致，其中2-ad-BAD的表现更接近BAD。为此，作者又测试了2-ad-BAD以UV依赖型的方式标记PARP的能力。由于在缺乏受损DNA时，PARP的NAD结合位点会在空间上封闭，只有存在受损DNA时，由于PARP与DNA的结合才会使得NAD结合位点暴露出来。因此，作者在存在/缺乏受损DNA时对PARP进行孵育，然后再与2-ad-BAD进行孵育并照射UV，以非特异性的PAL探针作为对照，说明了2-ad-BAD只能在UV存在下对PARP进行有效的标记。使用PARP的抑制剂进行竞争性标记实验，发现2-ad-BAD可以被抑制剂竞争，证明了2-ad-BAD的结合是位点特异性的。

之后作者进行了化学蛋白质组学的鉴定，用2-ad-BAD和6-ad-BAD对于HEK 293T细胞裂解液进行了标记，并用带叠氮标签的脱硫生物素进行富集，鉴定到了74种蛋白。对其进行进一步的分析，发现这些蛋白已知的主要以NAD⁺/NADH、ATP、AMP、GTP、ADPr、FAD为底物的蛋白为主，此外还鉴定到24个未知的NAD或相关核苷酸的结合蛋白。Western印迹的结果与LC-MS/MS一致，印证了该结果。

      总之，作者开发了一种利用PAL的NAD⁺/NADH探针，可以以UV依赖的方式对与NAD结合蛋白进行鉴定，可用于分析多个PARP家族成员中PARP抑制剂的选择性，并且可以鉴定到未知的NAD结合蛋白。尽管可能由于空间位阻等原因，2/6-ad-BAD无法鉴定到全部的NAD结合蛋白，但可以预见基于PAL的NAD探针将在未来的化学蛋白质组学研究中发挥重要作用。

本文作者：WZY

责任编辑：GZH

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c01302

文章引用：DOI：10.1021/jacs.1c01302