荧光成像技术十分强大，揭示了细胞中蛋白质和核酸分子的空间信息。然而，荧光团的光谱重叠将可同时区分的目标的数量限制在五个左右，这阻碍了对涉及许多生物分子的复杂生物功能的理解。为了克服这一限制，已经开发了几种多重成像方法，包括多重振动成像和光谱成像。使用染料结合抗体的连续免疫染色方法也实现了多重蛋白质成像。尽管这些新技术实现了多重成像，但所需的成像迭代次数与检测到的分子数量成线性比例增加。沃森-克里克碱基配对的DNA纳米结构的可编程性使得各种标记技术的发展成为可能。使用DNA共轭抗体的DNA条形码技术已被用于通过重复杂交和去杂交方法以及使用带有染料标记核苷酸的DNA聚合酶来实现空间多重蛋白质检测。然而基于DNA的方法需要许多不同序列的探针、复杂的操作和特殊的仪器，其广泛应用受到限制。尽管DNA技术非常强大，但为了实现通用的多重标记方法，必须克服一些问题。

名古屋大学的Hiromu Kashida和Hiroyuki Asanuma团队在《Journal of the American Chemical Society》上发表了题为“Color-Changing Fluorescent Barcode Based on Strand Displacement Reaction Enables Simple Multiplexed Labeling”的研究论文。在此论文中，该团队报告了一种变色荧光条形码(CCFB)方法，基于连续的toehold介导的链置换反应，利用简单和小的核酸结构设计实现了多重标记。CCFB的发射颜色可以以预定的顺序变化，从而可以同时检测多个目标。CCFB复合物由若干个寡核苷酸组成，其颜色序列可以进一步扩展。CCFB方法操作简单且省时，通过加入互补的寡核苷酸而引发不可逆的变色反应。

图1. CCFB方法的原理。(a)由寡核苷酸组成的线性CCFB复合物的示意图，所述寡核苷酸在每个末端修饰荧光团和淬灭剂。在条形码复合物的初始状态，只有末端荧光团发射荧光，其他荧光团由于与邻近寡核苷酸的淬灭剂相互作用而被淬灭。随后，互补猝灭剂链与toehold区域杂交，并通过toehold介导的链置换反应除去末端寡核苷酸，猝灭第一荧光团的荧光，并由于附近猝灭剂的缺失而允许第二荧光团发荧光。可以重复链置换以导致荧光颜色的变化。(b)CCFB成像示意图。每个点的发射颜色通过荧光显微镜观察。可以通过从采集的图像中解码颜色序列来识别多个目标分子。(c)D-aTNA和DNA的化学结构。

图2. 荧光颜色随CCFB而变化。(a) 两次改变荧光颜色的CCFB系统的示意图。与染料共轭的F链是有7-mer的互补序列。这些链的互补性使得五条寡核苷酸链形成线性复合物。Q链的加入引起了toehold介导的链置换，导致了荧光的变化。(b)添加Q1、Q2和Q3后，7-mer D-aTNA条形码Cy5→Cy3→FAM(左)和Cy3→Cy5→FAM(右)的荧光变化过程。箭头表示添加Q链的时间点。将荧光强度标准化为每个荧光团的最大强度(Fmax)。条件：0.2 μM条形码复合物，0.4 μM Q链，100 μM NaCl，10 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，20℃。

图3. 缀合到珠子上的条形码复合体的编码和解码。(a)在珠子上修饰条形码复合体的示意图。用生物素修饰其中一条F链，用于连接链霉亲和素包被的珠子。(b)添加Q链后珠子上条形码解码的图示。(c)初始状态和加入指定Q链后30分钟的荧光图像(Q1，30 pmol；Q2，60 pmol；Q3，90 pmol)，比例尺= 20 μm。(d，e)带有条形码复合物的珠子的荧光图像，颜色序列为(d) Cy3→Cy5→FAM和(e) FAM→Cy5→Cy3。标尺= 20 μm。(f)在图c(左)、d(中)和e(右)中显示的实验中每个荧光团的定量荧光强度。将每个珠子的荧光强度标准化为起始状态下第一个发射荧光团的强度。

图4. 用九个CCFBs标记珠子。(a)珠子上条形码的多重鉴别的示意图。(b)用九种不同的CCFBs (Cy5，品红；Cy3，黄色；FAM，青色)。比例尺= 20 μm。(c)图b中突出显示区域的九个CCFBs的颜色变化。(d)根据颜色变化分配图c中的珠子。分配由c图中指定的圆圈颜色表示。

图5. 使用与CCFB系统结合的鬼笔环肽条形码进行肌动蛋白成像。(a)制备鬼笔环肽-条形码偶联物的合成方案。(b)鬼笔环肽染色和共聚焦显微镜成像的示意图。将固定的HeLa细胞与200 nM鬼笔环肽条形码缀合物一起孵育30分钟，通过洗涤细胞去除多余的探针。在添加Q链之前获得荧光图像。加入Q链，温育30分钟，对细胞成像，对每条Q链重复此操作(Q1，30 pmol；Q2，60 pmol；Q3，90 pmol)。(c)在每个步骤获得的荧光图像。比例尺= 20 μm。(d)图c中每个图像中红线的线强度分布。荧光强度标准化为每个荧光团的最大强度。

图6. CCFB系统可在细胞中进行多重蛋白质成像。(a)合成抗体-条形码偶联物的方案。(b)免疫染色和CCFB成像示意图。将固定的HeLa细胞与第一抗体一起孵育，然后与条形码结合的第二抗体一起孵育。在添加Q链(Q1，30 pmol；Q2，60 pmol；Q3，90 pmol)之后获得荧光图像。(c-e)对(c) Golgin-97 (Cy5→Cy3→FAM)，(d) XBP1 (Cy5→FAM→Cy5)和(e) RPA32 (FAM→Cy5→Cy3)染色的细胞荧光图像。(f)用CCFB系统进行多重免疫染色的示意图。将条形码结合的抗体同时加入到细胞中，Q链的加入改变了所有条形码上的发射荧光团。(g)使用与不同CCFBs偶联的抗体对HeLa细胞中的Golgin-97 (Cy5→Cy3→FAM)、XBP1 (Cy5→FAM→Cy5)和RPA32 (FAM→Cy5→Cy3)进行多重成像。比例尺= 20 μm。

在本篇文章中，作者提出了一种新的多重标记方法的开发和验证。CCFB系统比使用DNA纳米结构的荧光条形码标记方法体积要小得多(总双链长度为42个碱基对，小于30 kDa)。由于CCFB设计的便利，作者展示了一个只用14条D-αTNA链制备27种不同CCFBs的系统。由于条形码的数量可以成倍增加，因此CCFB系统的高可扩展性是突出的。CCFB的这种简便性大大降低了染料连接到核酸的合成成本。使用少量的链是由于toehold介导的链置换反应，该反应被用来诱导颜色变化。在该系统中，作者演示了在常规荧光显微镜上连续向样品中添加几条Q链可以同时引起CCFBs的颜色变化，从而能够检测到固定细胞中的多个蛋白质。在CCFB系统中使用了D-αTNA，因为它形成了非常稳定的双链，并减少了背景辐射。

CCFB方法可以用于多路蛋白质成像。使用CCFB的免疫染色方案不需要重复染色步骤，而重复染色步骤是传统多重免疫染色的主要问题之一。此外，CCFB还具有标记蛋白质以外的生物分子的潜力，可以应用于蛋白质−蛋白质和蛋白质−RNA相互作用的成像。此外，CCFB设计的顺序荧光变色能力也适用于其他基于DNA的技术，如DNA密码学。添加互补链可以解码用荧光颜色序列加密的信息。总之，CCFB方法是一种多功能的标记工具，将运用于生物学和纳米技术中。

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.1c09844

Hiroyuki Asanuma

Hiromu Kashida

两位通讯作者分别为名古屋大学教授、副教授，均来自研究生院工学研究科生物分子工学系ASANUMA实验室。研究兴趣：光反应DNA/RNA的开发；识别DNA/RNA的高灵敏度荧光探针的研制；以DNA/RNA为立足点的新染料簇的设计；非环状人工核酸SNA、aTNA的开发；核酸药物中人工核酸的开发；人工核酸非酶复制研究。

编辑：肖飞

审核：王洁瑜

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