今天给大家分享一篇近期发表于J.Am.Chem.Soc.的文章“Proximity-Dependent Labeling of Cysteines”，文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学医学院的Paul R. Thompson教授。他们课题组的主要研究重点是基于目标的新型抗癌和抗风湿性关节炎化疗药物的设计，目前正致力于开发有效的和选择性的酶抑制剂。

蛋白质-蛋白质相互作用在许多细胞过程中起着关键作用，在不干扰细胞微环境的情况下检测瞬时结合相互作用仍然是一个主要挑战^[1]。近年来虽然一些经典方法（例如，酵母双杂交^[2]）已被复杂的标记近端蛋白质（例如 BioID、TurboID和APEX）的化学方法所取代^{[3] [4]}，但这些方法会引入或产生一些对活细胞有毒的物质，影响细胞的氧化还原敏感途径及标记效率。因此，本文报告了一种新型的邻近标记策略，可以快速标记并高空间分辨识别相互作用的蛋白质，而不会引起显著的细胞毒性（图 1）。

受启发于烟酰胺N甲基转移酶 (NNMT)可以在S-腺苷-L-甲硫氨酸 (SAM)的存在下催化烟酰胺 (NAM)甲基化，形成N甲基烟酰胺 (Me-NAM)（图 1A），作者利用炔烃取代的4-氯吡啶（SS6；图 1B）作为NNMT底物来生成相应的具有高度亲电性的N-甲基化产物（N-甲基-4-氯吡啶SS7），SS7可以扩散出活性位点并与邻近蛋白质上的半胱氨酸反应（图 1B），被标记的蛋白质通过铜催化的叠氮化物-炔环加成 (CuAAC) 化学连接到生物素-叠氮化物上，随后在链霉亲和素珠上捕获富集，从而通过串联质谱法对其进行鉴定。这种修饰是NNMT依赖性的，该效应与N-甲基化比酶失活快有关，因此N-甲基化产物可以从活性位点扩散开并共价修饰邻近蛋白质上的可及半胱氨酸（图 1C、D）。

图 1. (A)NNMT 反应。(B) SS6使NNMT失活。(C)SS6提出的NNMT标记机制。(D) SIBLing示意图，一种基于自杀抑制的邻近蛋白标记技术。

为了证明该技术的实用性，作者将NNMT独立地融合到蛋白质精氨酸脱亚胺酶2 (PAD2)和丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1) 上，这些酶定位于细胞中的特定细胞器。通过测量喹啉甲基化率（荧光）确定这两种融合蛋白对NNMT的活性影响很小（图 2C）。接下来，作者用SS6和SAM处理细胞，然后用CuAAC将炔烃与TAMRA-N3或生物素-N3偶联。在用SS6标记仅5分钟后就实现了接近最大的标记，重要的是，SS6 不会对细胞产生任何显著的细胞毒性。

图 2. PAD2-NNMT融合蛋白的构建及相关测试

然后作者通过LC-MS/MS分析确定了与PAD2相互作用的蛋白质。将链霉亲和素捕获的生物素化蛋白质用胰蛋白酶进行珠上消化，通过蛋白质组学分析被SS7共价修饰的蛋白质的富集率（图 3A、B）。结果表明在PAD2-NNMT数据集中共检测到288种蛋白质，其中，在钙的存在下，155种蛋白质被富集（图 3A、B）。许多富集的蛋白质之前被报道为PAD2的相互作用蛋白。根据基因本体论 (GO) 富集分析，大多数在没有钙的情况下富集的蛋白质是细胞溶质中的（图 3C）。相比之下，当细胞受到钙刺激时，细胞会转向核蛋白（图 3D）。这些结果与PAD2的已知细胞定位一致。并且通过一系列比较证明了该方法的多功能性，与BioID早期迭代所需的12-18小时相比，标记时间仅为5分钟。

图3. PAD2相互作用蛋白

在确定了已知的PAD2相互作用蛋白并证明该技术可以监测PAD2进入细胞核的易位后，作者接下来试图进一步了解这种方法的空间选择性。将NNMT与编码丙酮酸脱氢酶激酶 1 (PDK1) 的基因融合，这是一种调节丙酮酸脱氢酶活性的线粒体酶。为了确认线粒体蛋白的选择性标记，作者用探针处理细胞的线粒体和细胞质部分，在线粒体部分中观察到的标记明显多于细胞质部分。接下来，通过蛋白质组学分析绘制了PDK1相互作用蛋白。在该数据集中共检测到834种蛋白质。其中，477种蛋白质的log2倍变化> 0（图 4E）。在富集的蛋白质中检测到PDK1及其底物丙酮酸脱氢酶（图 4E）。与PDK1-NNMT融合蛋白的线粒体定位一致，大多数富集蛋白来自线粒体（图 4F）。这些结果清楚地证明了SS6对近端蛋白质的细胞器特异性标记。

图4.PDK1相互作用蛋白，空间选择性分析

总之，作者开发了一种新型的邻近蛋白质标记技术，该技术利用了炔烃取代的4-氯吡啶，在N-甲基化后，高反应性的N-甲基化产物从活性位点扩散出来，并与近端蛋白质上的半胱氨酸残基发生反应。使用这项技术，确定了PAD2和 PDK1的已知和新型相互作用蛋白，标记动力学非常快（≤5分钟）并且标记具有高度的细胞器特异性。

胡程真

 黄硕课题组硕士研究生