今天跟大家分享一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，文章题目是“Color-Changing Fluorescent Barcode Based on Strand Displacement Reaction Enables Simple Multiplexed Labeling”，本文的通讯作者是Nagoya University的Hiromu Kashida和Hiroyuki Asanuma。本文报告了一种基于链置换反应变色荧光条形码（CCFB）的方法，能以简单和小的核酸结构设计实现多重标记。CCFB的发射颜色可以按照预定的顺序变化，因此可以同时检测多个目标。
荧光成像技术为了解各种生物现象做出了贡献，然而荧光光谱重叠大大限制了复用能力。已经报道了一些策略，通过利用DNA技术和纳米结构的卓越可编程性来克服这一限制，但在实践中，由于这些DNA设计的复杂性，要实现这些复用检测方法的广泛采用仍然具有挑战性。在此，本文描述了一种依赖于简单的线性核酸设计的多重标记方法的发展，称为变色荧光条形码（CCFB）方法。CCFB的发射颜色由立足点介导的链置换反应的核酸链的杂交决定,并且可以通过CCFB的颜色序列来区分多个分子。使用荧光显微镜可以看到每个CCFB标记的目标上的颜色变化。根据CCFB成分的数量，可检测的生物分子的数量可以成倍增加。本文采用了无环的d-苏氨酸核酸，D-aTNA作为CCFBs的成分。D-aTNA形成一个极其稳定的同源双链，但不与DNA或RNA形成稳定的杂交。因此，避免了与细胞内DNA或RNA的意外杂交。此外，由无环核酸组成的荧光探针比DNA探针具有更高的淬灭效率和信号-背景（S/B）比率。
作者设计的CCFB系统，其中有三个可区分的荧光体Cy5、Cy3和FAM。CCFB复合物由荧光体链（F1、F3和F5）组成，每端拴着一个荧光体和淬灭剂，还有连接链（F2和F4）。将所有的F链混合在一起，就会形成一个顺序的线性双链，初始的荧光体在一个端点。CCFB复合物的颜色序列可以通过依次加入三条淬火剂链Q1、Q2和Q3来解码，它们分别与F1、F2和F3完全互补。加入每条Q链会产生一个完全互补的双链，其中F链的荧光团被淬灭。因此，没有必要进行洗涤程序。淬灭步骤是不可逆的，因为释放的双链比初始复合物更稳定。颜色序列取决于F1、F3和F5链末端的荧光团。由于各种颜色序列可以由相同的Q链解码，复杂的纳米结构设计和大量的寡核苷酸对于CCFB标记系统是不必要的。作者首先研究了D-aTNA F链相互形成7-mer双链的条形码复合物的变色能力。在20℃下对具有Cy5→Cy3→FAM颜色序列的条形码进行了荧光测量。在初始状态下，观察到Cy5的发射，Cy3和FAM被淬灭，表明所需的线性复合物形成。加入Q1后，由于通过链置换将F1链从复合物中移除，Cy5立即熄灭，Cy3发射增加。随后加入没有淬灭剂的Q2，改变了荧光，因为去除F2诱发了第二个荧光团周围微环境的变化。相反，加入Q3会引起Cy3的严重淬灭，同时FAM的发射也会增加。因此，连续的链式置换反应导致发射颜色按照预定的顺序Cy5→Cy3→FAM变化。在成像应用中，Q2和Q3较慢的杂交动力学不会是一个严重的问题，因为在成像应用中，大量过量的Q链会被用来改变颜色。
为了证明CCFB的多重成像能力，作者对连接到7-mer D-aTNA复合物的聚苯乙烯珠子进行了荧光显微镜成像。D-aTNA链与生物素分子共轭，能够固定在链霉菌素涂层的珠子上。通过在珠子上添加适当的F链来制备具有Cy5→Cy3→FAM序列的条形码复合物。在初始状态下，荧光成像显示只有Cy5发射，证实了珠子上复合物的形成。加入Q1导致Cy3发射，而加入Q3导致FAM发射。用其他条码观察到不同的颜色变化序列。定量分析证实了这些变化。对珠子上的链式置换反应的动力学评估显示，荧光变化在加入Q链后3分钟内完成。总的来说，即使条形码被固定在固体上，也能有效地发生链替代过程。
接下来，为了验证CCFB方法的多重检测能力，作者评估了是否能同时分辨出具有九个不同条码的珠子。作者准备了一个用不同颜色序列编码的珠子的混合物。每个珠子都表现出不同的颜色变化。依次加入Q链可以诱导每个珠子中的链子位移。由于所有的条形码都是由具有相同序列的链组成的，没有颜色变化的条形码的链交换的完成可以从其他条形码的颜色变化中判断出来。通过监测颜色变化对条形码进行解码，并证明即使只采用了三种荧光团，所有九个条形码都可以被明确地分配。从这些结果中得出结论，CCFB方法可用于同时检测多重目标。应该强调的是，在这个实验中只使用了三条Q链，而且没有必要进行洗涤操作。解码这九个条形码总共需要大约1.5小时。因此，与传统的多重荧光成像相比，CCFB系统能以更简单的方案实现更快速的检测。
作者接下来用CCFB来检测细胞中的蛋白质。D-aTNA复合物首先与phalloidin结合，phalloidin是一种与F-actin结合的双环肽。硫醇修饰的D-aTNA通过异功能交联剂与氨基修饰的phalloidin耦合。通过杂交适当的D-aTNA链，将序列为Cy5→Cy3→FAM的条形码与phalloidin偶联。将phalloidin-条形码共轭物加入到多聚甲醛固定的HeLa细胞中。孵化30分钟后获得初始荧光图像。观察到一个丝状的图案，表明phalloidin与F-肌动蛋白的结合。加入Q链后，颜色按预期顺序变化。因此，CCFB标记可用于细胞中的蛋白质成像。
然后作者研究了CCFBs对免疫染色的适用性。一个带有硫醇基的D-aTNA低聚物通过类似于phalloidin连接的方法被连接到抗小鼠二级抗体上。具有Cy5→Cy3→FAM颜色序列的条形码通过D-aTNA链的杂交附着在抗体上。为了验证该蛋白可以用CCFB系统检测，首先选择了定位在高尔基体的Golgin-97作为目标蛋白。固定的HeLa细胞的荧光显微镜图像显示高尔基体的Cy5发射。加入Q链后，荧光按预期的顺序改变。定位于其他细胞器的蛋白质也可以通过CCFB标记而被观察到。当使用与Cy5→FAM→Cy5的条形码连接的抗兔抗体对XBP1进行染色时，如预期的那样从核仁中观察到发射。同样，RPA32，一种已知定位于细胞核的蛋白质，使用带有FAM→Cy5→Cy3条形码的抗大鼠抗体成功地被可视化。这些实验证实了CCFB系统正确地检测了目标蛋白，并表明与CCFB的连接不会干扰抗体的结合。 最后，作者评估了三种蛋白质的多重免疫染色。使用具有不同颜色序列的三种抗体同时对固定的 HeLa 细胞进行 Golgin-97、XBP1 和 RPA32 免疫染色。通过添加 Q 链进行 CCFB 成像。在每个细胞器中观察到不同的荧光变化。此外，在单一检测和多重检测之间观察到相同的模式，表明可以通过 CCFB 可视化多种蛋白质而不会相互干扰。作者还使用三种抗体-条形码偶联物和一种鬼笔环肽-条形码偶联物展示了四种蛋白质的 CCFB 成像。这些结果表明， CCFB 系统可用于细胞中的多重蛋白质检测，以克服可区分的荧光团数量的限制。
总之，本文开发了一种新的多重标记方法，即变色荧光条形码（CCFB）的方法。CCFB复合物由多个寡核苷酸组成，其颜色序列可以很容易地进一步扩展。由于只需加入互补的寡核苷酸就会发生不可逆的变色反应，所以CCFB方法操作起来很容易，也很省时。本文在此开发了27种不同的CCFB标签，只需要14种寡核苷酸。通过将CCFB标签附着在聚苯乙烯珠上，CCFB系统可用于标记多个目标。此外，当CCFB与抗体相连时，它可以被用来同时检测细胞内蛋白质。CCFB是一个多功能的标记平台，由于其简单性和复用能力，将在化学和生物学中找到广泛的应用。DOI: 10.1021/jacs.1c09844https://doi.org/10.1021/jacs.1c09844
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