第一作者：Zi Yao

通讯作者：Jennifer A. Prescher

通讯单位：University of California, Irvine

1. 荧光素衍生物分子的设计和荧光素酶结合位点的寻找。

2. 优化设计突变荧光素酶，获得高亮度荧光素-荧光素酶发光元并寻找正交荧光素-荧光素酶对实现多组分生物发光成像。

荧光素-荧光素酶体系常用于监测细胞和整个生物体的生物过程。对于传统的荧光素-荧光素酶体系，其检测范围有限且不易区分，难以实现细胞多细胞过程的成像和研究。此外，许多荧光素-荧光素酶体系发射的光组织穿透性差，难以实现深层组织的可视化检测。为了改善传统荧光素-荧光素酶成像效果，增大体系的发光波长和实现多细胞特征成像是目前面临的挑战。

生物计算模拟工具Rosetta在是分子预测设计的一个重要的工具，尤其在蛋白质分子的突变设计上。通过计算，Rosetta能够针对目标配体对蛋白质进行合理的突变设计，找到更为合适的蛋白质结合大分子。【1-5】

研究要点1：荧光素衍生物分子的设计和荧光素酶结合位点的寻找

为了解决目前荧光素-荧光素酶成像存在的问题，美国加州大学的Jennifer A. Prescher研究团队针对荧光素-荧光素酶体系进行重新设计，结合软件Rosetta提出了一种π-体系延伸的荧光素-荧光素酶成像体系，该体系具有更红的发射波长，并能够实现双组分生物发光成像。

图1. 设计的荧光素衍生物PhOH-Luc、荧光素-荧光素酶生物发光概念。

团队的出发点首先从荧光素开始。对于传统的荧光素体系，分子的发射波长在500 nm左右，其穿透性能较差。分子中具有大的共轭π体系能够使分子的发射红移，基于此，团队设计了新的π-体系延伸的荧光素衍生物：Ph-Luc。与传统荧光素相比，该分子中间加入了一个可旋转的苯环，使得分子的共轭增强。计算模拟显示该化合物能够发射大于800 nm的光，DFT计算显示Ph-Luc的苯环旋转的势能垒为~6 kcal/mol。Ph-Luc通过插入苯环，使得其在与荧光素酶结合前后能够通过苯环的旋转产生不同的发光状态，但由于酶与荧光素结合之后，其二面角的度数仍然是可变的。为了获得稳定且荧光发射强的体系，需要对酶和荧光素同时设计并固定其结合后的二面角，基于此，团队设计了另一个分子：PhOH-Luc，理论计算表明由于羟基造成的分子内氢键，其苯环部分比Ph-Luc具有更高的旋转能垒。这两种分子只有在独特酶的结合下才能产生荧光，而其他条件下由于TICT效应则不会产生荧光。基于此结构团队同样合成了其他同结构衍生物。

图2. A）荧光素酶介导的氧化荧光素产生生物发光的原理。B）平行设计荧光素衍生物-荧光素酶生物发光新体系的理念图。C）Ph-Luc与PhOH-Luc的分子结构式以及PhOH-Luc氢键的形成过程。D）Ph-Luc与PhOH-Luc的合成过程。

对两种分子的结果性质和光物理性质进行评估。通过荧光光谱可以看出，Ph-Luc与PhOH-Luc的发射分别为：442 nm & 595nm；529 nm。表明PhOH-Luc更容易产生共轭结构，发射明显红移。团队将Ph-Luc的595 nm峰归于溶液条件下分子内6’-OH的质子转移而PhOH-Luc由于分子两个-OH质子转移相互竞争而不容易发生，因而没有该处的发射峰。

图3. A）Ph-Luc与PhOH-Luc 在不同溶剂条件下的发光光谱。B）不同荧光素衍生物在不同溶剂条件下的荧光发射最大波长。

在荧光素分子设计完成后，团队将重心放至荧光素酶配体的设计。首先用常用的荧光素酶Fluc与设计分子Ph-Luc，PhOH-Luc作用，其复合物均表现出不产生荧光的状态，团队分析是由于设计荧光素与Fluc处理后形成的最终状态二面角不利于荧光发射，为暗状态。因此，需要设计的分子进行发光就需要对结合的荧光素酶进行改造。基于生物计算模拟工具Rosetta，团队模拟和缺点了荧光素酶蛋白的突变位点，并结合与Ph-Luc，PhOH-Luc的对接进行合理的突变设计，最终获得了一个突变荧光素酶的分子库。根据设计残基和荧光素类似物之间的形状互补性，Rosetta对得到的突变体进行了排序。在设计的配体基础上，每个酶库分子有3-4个位点发生突变。从两方面对能够与Ph-Luc和PhOH-Luc结合发光的方面。之后将筛选荧光素酶基因导入细菌，用过发光菌落被识别，任何突变体在显示出或比Fluc强的光发射都将被筛选。最终，团队筛选出了一些具有良好性能的荧光素酶突变体。与传统的野生型相比，筛选酶与PhOH-Luc结合后能产生更好的发光性能，而计算显示Ph-Luc则需要突变大于4个的位点进行改造，因此团队决定专注于PhOH-Luc酶的设计。

图4. A）Ph-Luc和PhOH-Luc与荧光素酶Fluc的模拟对接。B）对传统荧光素酶几个氨基酸残基的突变方案。C）通过Rosetta突变筛选出的酶与Ph-Luc和PhOH-Luc生物发光的性能。D）识别互补荧光素酶的两层筛选策略。通过该策略筛选与荧光素衍生物具有良好结合性能的突变荧光素酶。

使用Rosetta分析了荧光素酶的结合位点为G1和G2，两处位点的突变部分为G1：E311C, A313G；G2：S220N。Glu311参与了包含多个水分子和活性位点侧链的氢键网络。这个网络的中断可以提供空间容纳π扩展的荧光素。Ala313在其中的作用可能可以改变荧光素分子的构象而S220N则可能通过赋予了额外的热稳定性增强荧光。通过PhOH-Luc与野生型和突变荧光素酶的滴定实验，可以看出突变酶具有更好的发光性能。研究了几种发光体系的发射光谱，与Fluc和D-luc相比，G2和PhOH-Luc表现出红移的λmax，根据总光子量，团队得出约30%的光子波长> 650 nm。此外PhOH-Luc的光谱在700 nm处还产生了一个微弱的肩峰，团队将其归因于存在两种发光中心（柔性），分子对接模拟也显示PhOH-Luc的结合是扭曲的。此外由于激发后的质子转移，分子内的羟基很可能产生酮与烯醇的互变异构，团队认为这也是肩峰产生的一个原因。

图5. A）PhOH-Luc与G2突变荧光素酶结合、D-Luc与传统荧光素酶Fluc、D-Luc与G2突变荧光素酶结合的生物发光光谱。B）PhOH-Luc滴定筛选的突变荧光素酶与传统荧光素酶的荧光滴定曲线。C）、D）和E） PhOH-Luc与突变的荧光素酶结合的空间结构，通过分子对接获得。

研究要点2：优化设计荧光素酶，获得高亮度荧光素-荧光素酶发光元并寻找正交荧光素-荧光素酶对实现多组分生物发光成像

团队通过多代的常规诱变并锁定已知可调节底物结合的残基，对荧光素酶的结合位点G2进行进一步优化。最终建立了62个具有G2活性的酶库，之后用PhOH-Luc筛选一组功能突变体，同时制备两种包含所有有益突变的酶。团队将筛选的荧光素-荧光素酶发光元用于HEK293细胞的成像，与传统的荧光探针性能相当。

图6. A）筛选获得的荧光素酶突变位点，这些位点的突变能够适应不同的荧光素衍生物的结合。B）从每一轮突变位点中筛选出来表现最好的酶与PhOH-Luc结合后的生物发光强度增强情况。C）HEK293细胞表达不同的荧光素酶或不表达荧光素酶与饱和量的荧光素孵育进行细胞成像，记录发光的光子的总通量。D）HEK293细胞成像实验的光子输出列表。每个突变体/模拟对的相对发射值。

根据筛选得到的荧光素酶具有对不同荧光素设计衍生物的特殊结合偏好，团队基于此联想是否可以将所设计的荧光素与这些荧光素酶一一匹配，实现生物正交成像（包括传统的荧光素-荧光素酶体系）。实现正交成像的条件的关键在于：1.两个荧光信号不能混合，要具有可区分度，使得信号能够分层。2. 使用第二种荧光素之前，从一个荧光素酶-荧光素对获得的信号必须清除，而清除过程往往需要数小时或数天。为了减少成像时间，团队开发了一个依赖于快速基质分解的平台，使得正交探针可以在最小延迟的情况下依次应用和成像。在本研究中，团队将其应用于所设计的荧光素发光体系中，首先尝试了PhOH-Luc与传统的D-Luc进行成像。按照正交成像步骤，使用表达酶的细菌进行实验，结果显示，PhOH-Luc与 D-Luc在对应不同的酶条件下能够产生清晰可辨的荧光信号。图像采集在10 ~ 15分钟内就可以完成，使用线性分离算法合并和处理产生伪彩色图像。结果显示，两种发光体系具有完全独立的发光信号不会产生相互干扰并且没有衬底干扰，实现了快速灵敏的双组分成像。

图7. A）PhOH-Luc、D-Luc与荧光素酶或其突变体的生物发光性能比较。B）通过底物分解多种荧光素酶实现多组分成像的原理图。荧光素类似物在最短的延迟时间内依次给药。C）荧光素-荧光素酶双组分分析模板。在不同浓度的荧光素酶浓度下添加荧光素/荧光素衍生物。

最后，团队将设计的荧光素衍生物分子在荧光素酶中筛选了具有结合偏好的荧光素酶突变体，得到多个具有良好发光强度的发光体系。并使用他们进行了同样的多组分成像，得到了良好的效果。

图8. A）筛选突变体荧光素酶在细菌中表达并加入不同的荧光素衍生物后的生物发光情况。B）将A)图实验部分结果以纯图像形式进行描绘。发射强度绘制为总光子通量值。

针对传统的荧光素-荧光素酶发光体系其检测范围有限、难以区分、难以实现细胞多细胞过程的成像等问题。美国加州大学的Jennifer A. Prescher研究团队从体系本身入手，设计了一系列基于π共轭体系扩展的荧光素衍生物，使用生物分子计算工具Rosetta设计了针对荧光素衍生物结合的荧光素酶突变体库。改善传统荧光素-荧光素酶成像效果，增大了成像体系的发光波长。并将设计的多个荧光素衍生物与对应偏好的荧光素酶结合，通过串联使用实现了多组分特征的快速灵敏成像。这种扩展的生物发光可以实现快速、多组分成像。

https://doi.org/10.1021/jacs.0c01064

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董真 （dongscu@163.com）

吴鹏课题组硕博连读生