本周分享一篇JACS上的文章“Middle-Down Mass Spectrometry Reveals Activity-Modifying Phosphorylation Barcode in a Class C G Protein-Coupled Receptor”，通讯作者是来自美国西北大学分子生物系的Reza Vafabakhsh，其主要研究兴趣是开发开发定量生物物理和细胞生物学分析技术。
G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜受体家族，它们介导人体几乎所有方面生理功能。过去研究表明，特定的GPCR磷酸化状态可能是一种使潜在信号结果多样化的机制（又称为磷酸化条形码，Phosphorylation Barcode）。因此，确定GPCR磷酸化状态对于理解GPCR的受体生理学和信号传导特性至关重要。在基于质谱的蛋白质组学分析流程中，除了使用广泛水解酶获得短肽的自下而上（Bottom-up）方法和分离分析完整蛋白质的自上而下（Top-down）方法外，还有折中的“自中而下（Middle-down）”方法，它是通过表征感兴趣的蛋白质区域获得其信息，同时简化了大蛋白或疏水蛋白的分析难度，适用于高度修饰的蛋白质及结构域。mGluR2是一种C类GPCR，可介导中枢神经系统的突触传递，并已成为治疗焦虑、精神分裂症、疼痛障碍和成瘾的候选治疗靶点。mGluR2有14个可能的磷酸化位点，它们都位于C末端尾部。因此，作者在本文中使用自中而下与平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring，PRM）耦合的方法，鉴定了常规和激动剂诱导的mGluR2的C端序列磷酸化位点，量化了磷酸化的位置及丰度。
为了选择性地分离和分析mGluR2 C末端，作者在表达细胞中使蛋白N末端带上EGFP，并在序列中添加TEV酶切位点，该受体可非常有效地输送到质膜并且具有功能，通过抗GFP免疫沉淀和TEV消化分离可获得完整C末端结构域。随后LC-MS通过PRM来定量该结构域中总磷酸化水平和磷酸化的位置分布。质谱中指定磷酸化化学计量的离子被分离，然后进行更高能量的碰撞解离（HCD），以产生保持修饰的肽段级碎片离子，在检测到的碎片离子池中C末端尾部被分为四个部分，在这些区域内磷酸化整体水平被相对定量，然后通过比较碎片离子的强度可量化异构体的相对丰度。作者发现在分离的C端结构域中，每分子C端可以具有0到4个总磷酸化修饰。且观察到所有磷酸化化学计量都存在多个洗脱峰，表明这些磷酸化状态以多种异构体的形式存在。且在量化了mGluR2的基础磷酸化状态后，作者研究了激活状态mGluR2磷酸化的影响。具体表现为，L-谷氨酸处理后磷酸化幅度发生显著变化，且虽然总体上C末端磷酸化的密度增加，但这种增长分布并不是均匀的，这暗示着mGluR2的C端结构域中的磷酸化以区域特异性方式影响受体信号传导。因此最后作者还进行了定点诱变，以探索磷酸化对mGluR2信号传导的影响，确定了mGluR2在跨膜螺旋7（TM7）近端区域的磷酸化在功能上调节受体对激动剂的敏感性。
总的来说，本文开发了一种结合自中而下质谱策略的定量方法，以分析人类细胞中GPCR的磷酸化状态，并预计这种技术将被调整并应用于其他受体，以广泛阐明细胞内GPCR磷酸化情况。
本文作者：FTY
责任编辑：JGG
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c10697
文章引用：DOI：10.1021/jacs.2c10697
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