选择性地调控蛋白活性的方法为剖析细胞中蛋白质的生物学功能提供了一种策略。使得蛋白功能丧失的策略，包括使用小分子抑制剂或基于转录组的mRNA沉默，得到了广泛的应用。然而，对于蛋白功能增益的方法发展较为缓慢。光激活已成为细胞环境中蛋白质功能的时空调控的通用型策略。在这种策略中，目的蛋白质的关键残基被封闭在一个光敏部分的笼子中，从而阻止蛋白的功能。随后通过光触发一处笼状物导致蛋白功能的恢复，具有优异的效率和时空分辨率。N-乙酰葡糖胺修饰（O-GlcNAc）是共价连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸羟基上的一种普遍的糖基化修饰。越来越多的证据表明，O-GlcNAc在控制蛋白质功能方面起着关键作用，一直以来，O-GlcNAc水平的下调已被证明与各种疾病有关。因此，通过靶向O-GlcNAc水解酶或O-GlcNAc转移酶（OGT）来调节O-GlcNAc水平已被研究为一种治疗策略。

近日，国家蛋白质科学中心秦伟捷教授和浙江大学生命科学学院易文教授在J. Am. Chem. Soc. 上共同发表了一篇题为 “Spatiotemporal Activation of Protein O‑GlcNAcylation in Living Cells” 的研究论文。报道了通过基因编码的光老化赖氨酸替换催化必需的赖氨酸残基来光控制细胞中的OGT活性。使得表达一种暂时失活的OGT形式成为可能，它可以通过光衰减迅速重新激活。通过使用基于质谱的定量蛋白质组学监测细胞O-GlcNAc和糖蛋白谱的时间依赖性增加来证明OGT活性的激活。进一步应用这种激活策略来控制成纤维细胞的形态收缩。除此之外，在胞浆中实现了OGT活性的空间激活。同时，该方法方法提供了一个有价值的化学工具来控制细胞O-GlcNAc的时空精度，这有助于更好地理解O-GlcNAc的功能。

图1 OGT在保内光活化策略的研究进展。A) 催化必需的赖氨酸残基通过遗传密码扩展技术囚禁在笼子中，以使酶失活。再用近乎不可见的光解除去笼状基团后，OGT的活性就恢复了。B) 对OGT催化位点的K842残基分析，表明K842是催化OGT和尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖反应所必需的残基。C) 使用基于吡咯赖氨酸的遗传密码扩展系统将类似物1的基因整合到OGT的K842位点中。设计了一种光学可控的OGT，用光笼模拟装置取代了K842。D)表达ph-OGT的293T细胞经365 nm，5 mW/cm²，72s，10cm的紫外线照射后继续培养1h，用抗体RL-2免疫印迹细胞裂解物。紫外光照射后，与对照相比，信号显著增加。证实了O-GlcNAc水平的提高源于细胞中OGT活性的光激活。E) 在OSMI-4存在的情况下，ph-OGT的激活仍然会随着时间的推移显著上调O-GlcNAc水平，说明只有一小部分ph-OGT被抑制。

图2 光激活OGT后293T细胞糖蛋白的质谱图谱。A) 糖蛋白捕获和分析的工作流程。同样批次的表达ph-OGT的细胞在OSMI-4存在的情况下，分别用或不用紫外光照射。分别于2、4、8h时间点收集细胞。裂解产物中的O-GlcN酰化蛋白用GalNAz酶标记，然后与炔基生物素偶联。标记的糖蛋白被捕获在链霉亲和素包裹的珠子上并进行蛋白质水解消化。得到的多肽进一步通过还原氨基18的二甲基标记法进行同位素衍生化，并进行质谱定量。B) 不同紫外恢复时间(2、4和8h)下鉴定的O-GlcN酰化蛋白的数量。C) O-酰化蛋白鉴定的log2折叠变化(x轴)和GlcN酰化蛋白log10 P值(y轴)的火山图。折叠变化>2和P值<0.01的蛋白质被认为是O-GlcNacylated蛋白质。表明不同的蛋白质表现出不同的糖基化速率。分析OGT光激活时两种蛋白上糖基化的变化，符合质谱分析。

图3 NIH3T3细胞形态收缩的光学控制。A) 在NIH3T3细胞中通过光激活OGT控制细胞收缩的示意图。在加入信号脂质鞘氨醇-1磷酸(S1P)后，细胞内OGlcNAc水平的降低导致成纤维细胞形态的快速收缩。因此，可以通过光学控制OGT活性来操纵细胞收缩。B) 细胞在不同条件下收缩的图像。用细胞面积百分比计算细胞收缩的程度，证明光激活OGT活性可抑制S1P诱导的细胞收缩。免疫印迹分析显示OGT在NIH3T3细胞中成功激活。

图4 OGT在胞浆中的空间激活。A) 用类似物1取代保守的赖氨酸，构建了光笼化sOGT(ph-sOGT)，并证实了其在紫外光照射下的活性。在亚细胞水平上研究了OGlcN酰化的空间激活。B) 光激活293T细胞胞浆和胞核O-GlcNAc的免疫印迹。通过这两种异构体的差异定位，ph-sOGT在胞浆中的唯一定位。因此，这项概念验证研究表明O-GlcNAc的亚细胞激活是可以实现的。

综上所述，本文开发了一种时空精确的光学控制活细胞中OGT活性的策略。由于大多数糖基转移酶含有一个关键的催化赖氨酸残基，有助于稳定核苷酸糖供体，这种生物正交赖氨酸光笼化策略可以扩展到各种糖基转移酶。此外，该策略还可以通过激活特定的异构体来研究特定糖基转移酶家族中特定异构体的底物特异性。

秦伟捷，国家蛋白质科学中心教授。

研究方向：

基于新材料和新试剂的低丰度功能蛋白质、修饰蛋白质/肽段富集分离、质谱鉴定及荧光成像新技术。

（1）创新性的制备了多种毛发状聚合物杂化颗粒固定化蛋白酶，获得了文献中对BSA最高的酶解效率，并将酶解时间缩短500倍。

（2）首创性的建立了基于可溶性智能响应材料的均相反应富集新策略, 有效解决了传统固态富集材料普遍存在固液界面传质阻力，抑制富集反应效率的问题；合成了多组分嵌段聚合物修饰填料，巧妙整合了不同固定相特有的亲和性，获得了目前最大规模的人尿液蛋白质N-糖基化数据集。

（3）采用内源性生物大分子为广谱型富集钓饵，实现了大于50%的已知RNA结合蛋白的最大规模鉴定。

易文，浙江大学生命科学学院教授，博士生导师

研究领域：

糖生物学，化学生物学，蛋白翻译后修饰，细胞代谢的调控机制

教育和研究背景：

2013-今，浙江大学生命科学学院教授

2018-今，浙江大学医学院附属第一医院双聘教授

2008-2012，博士后，美国加州理工学院

2002-2008，博士，美国俄亥俄州立大学

1998-2002，学士，复旦大学

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.1c11041