近年来，抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）逐渐成为抗体研发领域的重点内容，目前已有14例ADC化合物成功上市。ADC药物将小分子细胞毒药物共价偶联物到抗体上，利用抗体靶向递送细胞毒药物，实现肿瘤的选择性杀伤。传统ADC化合物的制备主要方式为随机连接方式，即将小分子药物随机共价连接到抗体的赖氨酸或半胱氨酸残基。但研究发现，随机连接的ADC化合物往往均一性较差、治疗窗口窄、药代性质不足等，而将小分子药物定量偶联到抗体的特定位点所形成定点ADC药物则具有更好的治疗指数，逐渐成为ADC药物领域研发的重点。目前，主流的定点ADC制备技术主要集中在THIOMAB技术、非天然氨基酸技术、连接酶技术、糖定点技术等，依赖于抗体的工程化改造或酶催化，技术瓶颈高。但由于抗体复杂的氨基酸组成，通过化学手段定点偶联小分子药物也一直充满挑战。其中，配体导向的定点偶联技术是一种潜在的方法，但冗余的配体难以释放或复杂的释放过程限制了该技术在定点ADC药物研发中的应用。针对上述问题，中科院上海药物研究所黄蔚研究员/唐峰副研究员团队开发了基于硫酯结构的新颖配体导向酰化试剂，在定点修饰抗体特定位点赖氨酸的同时自动释放冗余的配体结构，首次通过化学手段实现定点ADC的“一步”、“无痕”制备策略（图1），相应成果已在线发表于Angewandte Chemie International Edition。
该研究团队首先筛选了几种常见的活性酯形式，如NHS活性酯、硫酯结构、酚酯结构等，发现Fc配体导向的柔性硫酯片段可以在天然抗体上特异性地增加2个叠氮基团，且过程中Fc配体自动解离。但研究团队发现，该复合物在转移结构更大的生物素片段时，转移效率明显下降。研究团队基于配体-抗体Fc结构域晶体结构，对硫酯锚定位点、硫酯片段长度等进行了系统的筛选，发现基于巯基乙酸的硫酯片段偶联到Fc结合肽的10位氨基酸时，具有很强的转移活性，基于该位点的配体-硫酯-生物素偶联物在2小时内即可将2个生物素分子偶联到抗体上（图2）。随后，该研究团队对利用该技术获得的生物素化的抗体进行了位点分析，发现该技术可以将生物素定点偶联到曲妥珠单抗的K251位点，具有极高的位点选择性（图3）。
图2. Fc配体-硫酯-生物素复合物结构优化实现生物素的高效偶联
在建立上述技术后，研究团队构建了多种含有不同药物连接子的Fc配体-硫酯-药物复合物用于曲妥珠单抗的共价修饰。研究发现，所有的复合物均可以高效地实现天然抗体的共价修饰，在2小时左右即可实现抗体2分子药物的共价偶联。同时，该技术也同样适用于利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐单抗等IgG1抗体，帕尼单抗等IgG2抗体、纳武利尤单抗等IgG4抗体，具有很好的底物普适性（图4）。
最后，研究团队基于曲妥珠单抗制备了4种具有不同药物连接子的“一步法”定点ADC化合物；另外，研究团队基于该技术制备的叠氮修饰的抗体，制备了3种基于生物正交反应的“两步法”定点ADC化合物。分析发现，所有的定点ADC化合物均具有很好的结构均一性（DAR=2）、较好的稳定性、很强的体外肿瘤细胞抑制活性（＜0.1 nM）及极低的细胞毒性（≥1000 nM）。同时，相比随机偶联制备的阳性ADC化合物（DAR≈3.3），利用该技术获得的多个定点ADC化合物虽然具有更低的载药量（DAR=2），但显示出更强的体内肿瘤抑制活性（图5、图6）。
图5. 基于该技术的定点ADC药物亲水性及聚集稳定性分析
综上所述，该研究团队通过设计新颖的酰基转移试剂及对配体结构的优化，实现了天然抗体特定位点赖氨酸的“一步”、“无痕”定点定量修饰。该技术首次通过化学手段实现了定点ADC化合物的高效、均一制备，无需进行抗体的工程化改造，不依赖生物正交反应，且兼容多样化的底物结构和抗体类型，为定点ADC药物研发提供了重要的技术方法。该论文还得到了来自上海药物所周虎研究员、黄河研究员、刁星星研究员在小分子修饰位点鉴定方面的大力支持和帮助。该工作得到国家自然科学基金、中科院特别研究助理项目、上海市扬帆计划、上海市科技重大项目、杭州创新创业领导团队项目及临港实验室的基金支持。
A Traceless Site-Specific Conjugation on Native Antibodies Enables Efficient One-Step Payload AssemblyYue Zeng, Wei Shi, Qian Dong, Wanzhen Li, Jianxin Zhang, Xuelian Ren, Caihong Tang, Bo Liu, Yuanli Song, Yali Wu, Xingxing Diao, Hu Zhou, He Huang, Feng Tang, Wei HuangAngew. Chem. Int. Ed., 2022, DOI: 10.1002/anie.202204132
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