今天分享一篇由中国科学院上海药物研究所文留青研究员和周虎研究员合作，在Angew. Chem. Int. Ed.上发表的文章，题为“A Sensitive and Reversible Labeling Strategy Enables Global Mapping of the Core-Fucosylated Glycoproteome on Cell Surfaces”。在这篇工作中，作者利用野生型内切糖苷酶Endo-F3的严格受体特异性和糖苷合成酶M-Endo-F3的松散供体特异性，成功地开发了一种可逆转，灵敏的标记策略，用于细胞表面核心岩藻糖基化糖蛋白组可视化、定量和富集分析。
核心岩藻糖基化（Corefucosylation）是生物体内一种独特的蛋白糖基化，指的是α1,6岩藻糖（α1,6-fucose）连接在N -聚糖最内部的n -乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）残基上。其通过调节多种膜蛋白，与肿瘤生长、侵袭、转移、预后和免疫逃避等密切相关。在以往的研究中，通常使用凝集素来特异性捕获核心岩藻糖基化糖蛋白，因其成本低廉且易于操作，但依然存在亲和力较弱，存在交叉反应等特点，此外，通常使用检测岩藻糖转移酶8 (fucosyl transferase 8，FUT8，是催化核心岩藻糖基化的唯一酶)的基因表达也被用来评估核心岩藻糖基化水平，该方法存在耗时且准确度较低问题。所以，由于缺乏一种有效的分析方法来识别细胞表面核心岩藻糖基化糖蛋白，特别是糖基化位点，其功能机制的细节依然有很多未知之处。在本文中，作者利用开发了一种灵敏的、可逆的核心岩藻糖基化糖蛋白标记策略。利用生物素化探针对位于细胞表面的核心岩藻糖基化糖蛋白进行高灵敏度的选择性标记，标记的探针在被亲和树脂捕获后可以被酶进一步裂解。无痕切割允许通过质谱(MS)对核心岩藻糖基化聚糖和糖基化位点进行全局定位。
图1 核心岩藻糖基化糖蛋白标记策略
首先，作者使用糖苷合成酶M- Endo-F3（可用来合成核心核心岩藻糖基化糖蛋白的酶）将探针和核心岩藻糖基化糖蛋白结合。作者合成了化学探针1，2和3（如图1），探针1是M- Endo-F3的天然底物，探针2是一个 “两步探针”，需要额外点击化学来引入报告基团，探针3是通过PEG连接子与生物素结合的“一步探针”。实验表明，三种探针都能很好被M- Endo-F3结合上核心岩藻糖基化糖蛋白（转化率75%~85%）接下来，作者研究了探针2和3对利妥昔单抗（rituximab）中核心岩藻糖的靶向效果，实验表明，M-Endo-F3能有效地将所有探针导入抗体，且探针3的灵敏度比探针2高8倍。随后作者探究了这些探针是否可以用于跟踪复杂样品中的糖蛋白，作者以贴壁中国仓鼠卵巢细胞（Adherent Chinese hamster ovary (CHO) cells）为研究对象，实验表明，使用探针3的标记信号非常强，但探针2不适用于糖蛋白组学分析。在通过荧光标记对细胞表面进行定量实验中，也发现探针3的信号远比探针2强，并证明了探针3用于标记细胞表面核心岩藻糖基化的高灵敏度和特异性。最后，作者使用探针3建立了一套针对核心岩藻糖基化位点识别的策略（图2），其使用了野生型 Endo-F3来从固体树脂中释放捕获的岩藻糖基化糖蛋白，相较于以往破坏链霉亲和素和生物素相互作用的释放方法，该方法具有无痕切割的特点，不会出现标签依然留在糖蛋白上的情况。作者使用此策略分析，对两种乳腺癌细胞的细胞表面核心岩藻糖基化进行了全局分析。在这两种乳腺癌细胞系中都发现了大量与细胞迁移、细胞粘附和基质组织相关的核心岩藻糖基化糖蛋白，证明，核心岩藻糖基化可以调节一些重要的生长膜相关蛋白来促进肿瘤生长、侵袭和转移。此外，在高侵袭性细胞系MDA-MB-231中发现了许多特殊的糖蛋白和糖基化位点，这表明核心岩藻糖基化与肿瘤的关系比我们预期的要复杂。
图2 识别核心岩藻糖基化位点的策略
总而言之，作者成功地开发了一种可逆转，灵敏的标记策略，用于核心岩藻糖基化糖蛋白的可视化、定量和富集分析。利用野生型Endo-F3的严格受体特异性和M-Endo-F3的松散供体特异性，生物素化的“一步探针”可以特异性地安装在核心岩藻糖上，而不需要额外的化学反应，从而实现高度敏感的标记。此外，标记的探针可以进一步有选择地删除，而不留下任何散装标记。通过与质谱方法结合，能够对核心岩藻糖基化糖蛋白进行全局分析，将有助于发现新的药物靶点。
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