辅酶A （Co-enzyme A 或者CoA）是自然界中生命体必不可少的辅酶因子之一，广泛参与各种重要的生理过程，例如在脂肪酸代谢中，辅酶A 充当酰基载体。以辅酶A 为底物，由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶介导的翻译后修饰被称之为磷酸泛酰巯基乙胺化修饰（4’-phosphopantetheinylation），简称泛酸化修饰，它是辅酶A 调节蛋白质结构和功能的另外一种重要方式。

在哺乳动物细胞中，迄今为止，共有5个蛋白质底物被发现并鉴定出来，它们分别在脂肪酸合成，叶酸代谢和β-丙氨酸活化中发挥关键作用。鉴于泛酸化修饰在原核生物和哺乳动物细胞中均扮演着举足轻重的角色，因此，是否存在其它新颖的蛋白质底物成为了相关研究首要解决的问题。在之前的研究中，受限于非天然泛酸探针代谢效率和检测手段，当人们对哺乳动物细胞进行代谢标记时，发现仅仅只有蛋白质丰度较高的脂肪酸合成酶被标记，并没有发现其它已知和未知的蛋白质底物，致使哺乳动物细胞中泛酸化修饰的研究停滞不前。

北京大学化学与分子工程学院、北大合成与功能生物分子中心、北大-清华生命联合中心王初课题组（微信公众号：王初课题组）一直致力于利用化学蛋白质组学技术解决重要的生物问题。最近，该课题组研究人员在哺乳动物细胞水平泛酸化修饰底物的化学蛋白质组学鉴定分析中取得重要进展。研究人员首先通过对已知非天然泛酸探针进行实验分析和表征，借助于定量蛋白质组学技术，发现所得到的结果与之前报道的结果相吻合，仅仅只有泛酸化修饰的脂肪酸合成酶被标记并定量鉴定。通过对探针的结构和其它非天然泛酸类似物在哺乳动物细胞中的代谢结果进行综合分析，研究人员推测已知的探针很可能被细胞表面的泛酰巯基乙胺酶水解，从而导致代谢标记效率降低和非特异性标记。

为了解决这一问题，研究人员优化了非天然探针的结构，发现将中间碳链的增长和减少均能显著的提高代谢标记的强度。因此，研究人员选取了代谢标记效果较好的PP-3探针进行了定量蛋白质组学分析，与预测结果一致，所有的已知五个泛酸化修饰蛋白质均被鉴定，而且富集比值显著高于其它蛋白质。同时，为了验证PP-3能够模拟天然泛酸化修饰，研究人员在细胞中加入了泛酸化修饰前体分子维生素B5（VB5）进行竞争，已知泛酸化修饰蛋白质的非天然代谢标记明显减弱。这是首次在哺乳动物细胞中实现所有已知泛酸化修饰蛋白质的化学标记，并在内源水平上进行了定量鉴定。

之后，研究人员采用了连续正交酶切策略对泛酸化修饰位点进行直接质谱鉴定。引入了“轻”和“重”同位素标记的生物素标签，能够使泛酸化标记的肽段具有明显同位素分布表型，显著区别于其它没有标记的背景肽段。研究人员运用靶向化学蛋白质组学策略对同位素标记的泛酸化修饰肽段进行了靶向分析。最终，研究人员共鉴定到了六个非天然泛酸探针标记位点，其中包括五个目前已知的修饰位点。另外一个新位点是mitochondrial dehydrogenase/reductase SDR family member 2 (DHRS2) 的第231位丝氨酸，该修饰位点此前没有被报道过，其天然修饰形式和生理功能仍有待后续研究确证。

总之，在本工作中，研究人员将化学探针和蛋白质组学技术充分结合，首次在全蛋白组位点水平上对所有已知泛酸化修饰蛋白质进行了鉴定，同时发现了一个新颖的潜在修饰位点。该工作将为今后研究哺乳动物细胞中泛酸化修饰对于蛋白质结构和功能调控、相关小分子抑制剂的筛选提供了一个有力的化学生物学工具。

论文信息：

Chemical proteomic profiling of protein 4'-phosphopantetheinylation in mammalian cells

Nan Chen, Yuan Liu, Yuanpei Li and Chu Wang

王初课题组致谢科技部、基金委、北京分子科学国家研究中心、教育部生物有机和分子工程重点实验室的支持。

Angewandte Chemie International Edition

DOI: 10.1002/anie.202004105