今天给大家分享一篇发表于Angew.Chem. Int. Ed.的文章，标题为DNA Tiling Enables Precise Acylation-Based Labeling and Control of mRNA。通讯作者是斯坦福大学的Eric T. Kool教授。

研究mRNA生物学和未来的治疗方法需要位点选择性标记RNA的方法。目前的方法是改造RNA序列，但这可能会改变RNA的折叠，或受限于特殊序列或碱基而无法改造。作者通过新的DNA平铺法，提出名为TRAIL的方法，利用寡脱氧核苷酸保护池来杂交mRNA和阻断酰化反应。RNA与诱导DNA结合后，可以在预定位置挤出活性RNA位点进行酰化。被标记的RNA可以用于RNA结合蛋白的分析、细胞中mRNA的成像以及翻译的分析和控制。TRAIL方法提供了一种有效可行的方法，可以标记几乎任何长度或起源的RNA，而不改变RNA原序列。

作者在先前的工作中，开发了环诱导的短RNA位点编辑策略。长RNA编辑的挑战在于在阻断整个RNA序列反应的同时，在一个特定位点诱导一个环。作者在此使用一个互补的DNA寡核苷酸保护池，与RNA结合并使RNA平铺（图1）。环位点上的2'-OH可以选择性地与酰化试剂（如NAI-N₃）反应，在DNA消化和柱纯化后，生成特定位点的mRNA偶联物。酰化反应引入的叠氮化物可以进一步用于添加荧光基团或生物素标签。mRNA在不同区域（非翻译区（UTR）、多聚腺苷酸尾或开放阅读框（ORF））的选择性环位点上都能被有效酰化。

为了探索mRNA的保护和诱导途径，作者首先要确定DNA平铺对RNA功能的影响。作者在此方法中，用数十条DNA与RNA互补，这就会导致有许多缺口，长RNA可能因此大量酰化。此外，消化后残余的互补DNA可能会沉默mRNA。作者用编码绿色荧光蛋白（GFP）的996 nt的mRNA测试。为了监测DNA平铺后的RNA功能，作者比较了未经处理的mRNA（UT）和从完全互补的DNA平铺处理后纯化得到的mRNA（FC），对比这两者的体外翻译效率。结果表明，两者的翻译效率几乎相同（图2a）。

随后，作者研究了RNA特定位点的诱导反应，用设计的诱导DNA替换保护DNA。30-60 nt的诱导DNA直接与RNA结合，但空出3-7个互补核苷酸，从而形成RNA凸起环。作者测试了从5'UTR到3'UTR中的7个位点。构建的mRNA与NAI-N₃反应，然后去除DNA。作者使用FC mRNA作为体外翻译的阳性对照，其GFP表达水平归一化为100%。不同位点被酰化的mRNA表现出明显不同的翻译能力（图2b）。

为了进一步评估特定位点反应策略的选择性，作者用RT-qPCR和PAGE胶分析酰化的mRNA。作者设计了6对引物用于RT-qPCR，以探测每个酰化位点（5U-1除外，因为它非常接近5'-cap）（图2c）。已知酰化会影响RT酶的效率。PCR结果表面明，酰化导致了明显的低扩增，有效RNA水平只有阳性组的0.3-0.4（图2d）。同样，PAGE凝胶分析显示，RT引物延伸的cDNA在接近酰化的位点上被截断（图2e）。

简而言之，实验表明，通过保护DNA和诱导DNA，mRNA可以在选择性诱导的环位点上高效地被酰化。

下一步，作者评估是否可以利用这种位点特异性修饰方法进行阻断（笼化）并随后激活翻译。不稳定的笼型RNA可以被化学物质或光激活。将长mRNA关入笼中，可能在基因表达的研究中会有广泛的用途（例如在胚胎发育中）。作者首先探索了在ORF区域的特定位点上酰化来控制翻译的可能，使用NAI-N₃试剂进行酰化反应，该反应在磷化氢处理下化学可逆。作者测试了单个ORF位点和联合酰化位点的效果（图3a）。数据表明，在体外，酰化mRNA的GFP表达被有效抑制至未酰化mRNA（FC）的5-15%。在单环的样本中，可以在逆转后恢复至50-70%；两环恢复至40-50%；三环恢复至30-40%（图3b）。

作者接着测试ORF酰化mRNA是否可以在不同的酰化位点诱导核糖体停滞。核糖体停滞表现为其在mRNA特定密码子位置的局部积累。这是识别缺陷mRNA的重要线索。控制核糖体在预设位置的停滞能力可以作为研究该机制的有效工具。作者使用局部酰化来停止翻译，并通过抗嘌呤霉素抗体的WB检测由此产生的截短肽（图4a）。作者成功检测到与GFP mRNA OR5到OR11下游ORF酰化位点相关的截短肽（图4b）。而在OR1和OR3上游端具有酰化位点的mRNA并没有明确的停止肽。在停止位点，作者发现磷化物移除了酰化阻断基团，导致停止肽消失（图4c）。

RNA偶联的一个重要应用是通过生物素化识别相关蛋白。对于mRNA，最好在一个不影响生物活性的位点进行偶联。UTR位点的酰化保留了mRNA的翻译能力，作者用TRAIL进行UTR酰化和生物素化，并测试其识别相关细胞蛋白的能力。酰化剂NAI-N₃含有叠氮化物官能团，通过与环辛炔反应可以进行生物素化。为了验证，作者通过TRAIL在5'UTR安装了一个叠氮基团，与生物素化试剂Biotin-DBCO反应（图5a），并用已知的mRNA相关蛋白PABP做pull-down实验来验证（图5b）。通过转染生物素化mRNA，作者从细胞裂解液和活细胞中进行了pull-down实验。WB结果显示，5'UTR生物素化的mRNA可以通过两种方式成功捕获PABP，而缺乏生物素的叠氮mRNA和未处理的mRNA的对照没有显示蛋白带（图5c）。

随后，作者将荧光基团连接到mRNA上，应用于可视化mRNA和mRNA在活细胞翻译。为了实现三色细胞成像，用Cy5标记mRNA。蓝色通道用于Hoechst 33342（细胞核），绿色通道用于GFP（翻译效率），红色通道用于Cy5标记的mRNA。将Cy5标记的mRNA转染到HeLa细胞，显示对应的亮红色图像（图6a，6c）。为了评估mRNA不同标记位点的细胞内翻译效率，作者在mRNA中不同位置标记Cy5（图6b）。观察到UTR标记和多聚腺苷酸尾标记的mRNA中，GFP高效表达，而ORF相反（图6c）。结果证明了一种不阻碍翻译的原位荧光mRNA标记方法的成功。

作者进一步测试TRAIL标记的mRNA与蛋白的作用。作者监测Cy5标记的mRNA及其在应激颗粒存在/不存在下的翻译水平（图7a）。应激颗粒（Stress granules, SGs）是细胞质中的无膜细胞器，由响应应激的mRNA和结合RNA的蛋白组成。SGs由亚砷酸钠诱导，提供氧化应激，用G3BP1蛋白的抗体进行观察，该蛋白被证实启动应激颗粒的形成。作者发现，在应激颗粒存在的情况下，无论标记位置如何，GFP的表达水平都显著降低（图7b）。并且在亚砷酸钠处理后，Cy5标记的mRNA（红色）的信号被共定位到G3BP1标记的SGs（蓝色）上（图7c, 7d）。由此，作者得出结论，TRAIL可以用于荧光标记mRNA，而不会对翻译或亚细胞间的结合产生强烈干扰。

综上所述，作者开发了名为TRAIL的方法，可以对长RNA进行位点选择性修饰，高效便捷，而不影响RNA本身的生物学特性。