灵敏而准确的蛋白质分析对疾病的诊断，监测和管理至关重要。然而现有实验室规模的蛋白质分析仪器由于成本高且针对非技术用户的操作规程复杂，不允许在初级医疗机构，患者卧床或家庭环境中对患者进行频繁的筛查和监测。电化学检测由于具有检测灵敏度高、读数快速以及与低成本和小型化的读出电路兼容的特点，非常适合即时（point-of-care,POC）蛋白生物传感[1]。但是大多数电化学蛋白质生物传感器无法以sample-in-answer-out（SIAO）的方式运行，特别是面对未经处理的临床样品时[2]，主要原因是这些检测方法依赖于多个步骤，包括洗涤、靶标标记、添加试剂以处理样品以及放大和转导信号等。基于可编程DNA的测定法已用于将蛋白质捕获与内置信号转导整合在一起，从而消除了多步处理的需要[3]，在这些方法中，响应蛋白质识别而生成核酸条形码的生物条形码测定法（bio-barcode assay）有望简化蛋白质分析[4]。
今天为大家分享的这篇2020年发表于Angew. Chem. Int.Ed.的文章：Dynamic Bio-Barcode AssayEnables Electrochemical Detection of a Cancer Biomarker in Undiluted Human Plasma: A Sample-In-Answer-Out Approach，将生物条形码检测的简便性与电化学读数的灵敏度相结合，创建了一种用于分析临床样品的SIAO电化学生物条形码测定法（e-biobarcode assay）。具体而言，该方法整合了：（1）感应诱导式生物条形码测定法，旨在通过一锅法操作进行电化学信号传导，（2）使用三维纳米结构电极进行电化学读数，以提高灵敏度，（3）使用聚腺嘌呤（poly-A）的表面涂层，用于减少非特异性吸附和生物污染（图1）。这些成分的独特组合使之能够以SIAO方式对未稀释的人血浆样品进行蛋白质分析，而无需进行样品处理。本文通讯作者是四川大学李峰教授与麦克马斯特大学Leyla Soleymani教授，主要研究方向包括DNA纳米技术、生物分析化学、体外诊断试剂及辨析仪器开发。
为了验证设计的生物条形码方法，作者首先通过实时荧光测定，验证蛋白质（以链霉亲和素作为模型蛋白）结合可触发条形码DNA链的释放。使用分别在TB和B*C DNA的5'和3'末端修饰的生物素分子捕获链霉亲和素，六个碱基对长的互补区（图2a中绿色域），在室温下不能形成稳定的双链体，在识别同一链霉亲和素分子后，迫使它们通过聚胸腺嘧啶间隔基（图1a，灰色域）靠近在一起，杂交并形成DNA /蛋白质复合物（图2a）。T*C*（红色域）中的支点区域与TB：B*C双链体暴露的单链区域杂交，可实现链置换，从而释放CR*。接下来，CR*与DNA双链探针CP（荧光团）：D1（淬灭剂）结合，释放D1链，从而产生荧光信号。使用该方法，测得20分钟时的信噪比为13.5（图2b），表明该方法可靠，快速，几乎不受未结合的生物识别元件的干扰。
图2. 使用链霉亲和素-生物素作为模型体系进行biobarcode验证
在用荧光法证明该生物条形码设计的合理性之后，作者将其与电化学检测相结合，设计了e-biobarcode法。首先将捕获探针（CP：D1复合物）固定在电极表面上，消除了荧光测定中所需的淬灭剂和荧光团，并用电化学报告分子亚甲基蓝（MB）修饰CR*。用于电化学信号转导的3D纳米结构金电极通过三个分子层功能化，这些分子层用于捕获探针CP：D1并排斥生物背景（巯基己醇（MCH）和poly-A）。基于此，作者建立了一个SIAO系统，先将样品加入包含反应混合物的试剂瓶中，然后取一滴溶液加入芯片中进行电化学测量（图1a）。在目标分析物存在的情况下，释放的条形码CR*与固定的捕获探针杂交并置换D1，使MB部分靠近电极表面，从而产生电化学信号（图1a，b）。为了检验e-biobarcode测定的可行性，作者建立了一个以链霉亲和素为靶标和平面金为电化学传感器的系统。蛋白质浓度的增加会增加MB还原所产生的电流（图2c）。该传感器在1 pM–10 nM浓度范围内显示出对数线性响应，并且检测限（LOD）达到208fM（图2d）。
图3.评估e-biobarcode测定法对PSA的电化学检测性能
为了证明该传感器可用于检测相关的癌症蛋白生物标志物，作者将前列腺特异性抗原（PSA）作为靶蛋白，并将多克隆抗PSA抗体缀合至TB和B*C基序。当PSA结合上后，形成DNA-抗体/蛋白复合物，并启动程序化的链置换反应，从而导致随后电化学信号的产生。结果表明，在平面电极上测得的电化学电流随PSA浓度的增加而增加（图3a）。在0.5至100ng•mL-1的对数线性范围内分析PSA，LOD为2 ng•mL-1（图3c）。在临床应用中，高于4ng•mL-1阈值水平的PSA浓度即可指示前列腺癌。随后，作者比较了3D纳米电极与平面电极的性能（图3c，d），使用e-biobarcode分析法分析PSA。3D纳米电极在临床相关的对数线性范围0.5 ng•mL-1-200ng•mL-1内的PSA检测灵敏度为0.14μA/log(ng•mL-1)，LOD为0.3 ng•mL-1。与平面电极相比，使用3D纳米电极可显著提高灵敏度（四倍）和LOD（六倍），从而更适合临床分析。
图4.在存在生物干扰材料的情况下对e-biobarcode测定法性能的验证
然而真正临床分析中的溶液环境要复杂得多，往往会含有其他可以降解测定试剂或非特异性地吸附到电极表面影响传感性能的大分子。为了避免这些影响，作者利用腺嘌呤碱基和金之间的强亲和力使用了poly-A链进行表面处理，以减少可用于非特异性吸附干扰生物分子的未反应电极的表面积。之后检测了未稀释人血浆中掺有PSA的样品，结果依然比较理想，LOD为0.4 ng•mL-1，并对其特异性进行了测试（图4）。综上，本文设计的e-biobarcode测定法将生物条形码技术与电化学检测结合，可在未经稀释和处理的人血浆中分析蛋白质，并具有临床决策所需的分析灵敏度和特异性。重要的是，这种分析以sample-in-answer-out的方式进行，而无需依次添加试剂或进行多步处理，为在现场进行临床决策提供了可能。
【原文链接】
https://doi.org/10.1002/anie.202009664
【文章DOI】
10.1002/anie.202009664
【参考文献】
[1]D. Vestergaard, K. Kerman, E. Tamiya, Sensors 2007, 7, 3442–3458.[2]A. J. Bonham, N. G. Paden, F. Ricci, K.W. Plaxco, Analyst 2013,138, 5580 –5583.[3]B.-K. Oh, J.-M. Nam, S.W. Lee, C. A. Mirkin, Small 2006, 2,103 –108.[4]J. M. Nam, C. S. Thaxton, C. A. Mirkin, Science 2003, 301, 1884 –1886.
【本文作者】
胡程真
黄硕课题组硕士研究生
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