一作： Huixin Luo

通讯作者：Peng Chen

【背景介绍】

RNA与蛋白质的动态相互作用在调控各种细胞过程中扮演着重要的角色。具体来说，RNA的调控受RNA偶联蛋白（RBPs）的控制，主要影响RNA的定位、转录、降解等。因此，对RNA-蛋白质的相互作用施加微扰则会引发细胞的功能紊乱，进而引发各种疾病。因此，全面理解这一类相互作用对于揭示在细胞过程中隐含的基本原理十分重要。目前为止，已发展了许多研究RBPs蛋白的方法被相继报导。例如，传统的基于紫外偶联技术将RBPs与同源的RNA通过共价键连接，尽管这种方法通过直接接触保证了偶联的准确性，但同时引入了紫外细胞毒性，且效率较低。为了克服这一问题，科学家发展了邻近标记酶催化方法，辅以其他技术可以实现RBPs蛋白的生物素标记。然而，这种方法只能应用在可以基因转染的体系，极大的限制的该方法的广泛应用。

程鹏教授课题组常年以来致力于化学生物学，发展活细胞偶联方法。本文在前期的工作基础上，发展了一种可以在细胞中原位偶联研究RNA-蛋白质相互作用的方法。该方法继承了前人工作的优势也克服了存在的不足：具有直接接触获得的偶联准确性高、偶联效率高、应用范围广、时间响应快的特点。

【工作创新点】

• 发展了一种新型的光催化引发的生物偶联方法，相比于传统研究RNA-蛋白质相互作用的方法有较大优势。

【结果与讨论】

1.      偶联策略

在考虑了不同生物大分子的活性之后，作者设计了一种双功能的偶联分子，一端为呋喃，另一端为氨基。在紫外光的照射下，活性氧物种将激活蛋白质支链中的某些氨基酸（酪氨酸、色氨酸、组氨酸），使其与氨基相连，如图1b所示。与此同时，最近基于呋喃的DNA偶联技术被报导。呋喃基团可以转移到胞嘧啶中间体上（如图1c），从而实现RNA-蛋白质的偶联。与扩散偶联的策略不同的是，该方法依赖于偶联分子的长度和变形性，可以极大的减小“假阳性”偶联。荧光染料曙红作为光催化剂，用于细胞体系中产生¹O₂。作者通过液相、gel-filtration，相互作用分析等技术表征了该探针的偶联效率以及可行性。

图1. 偶联策略示意图以及相关验证结果。

2.      蛋白质组研究

在实际体系中，作者首先选取了脂多糖刺激的巨噬细胞模型。原因在于在脂多糖是细菌细胞膜外壁的主要成分。当体系引入该物质后，会引发巨噬细胞全转录组发生极大改变，有报导表明RBPs会影响免疫响应中的翻译后修饰。作者共分析了1926个蛋白质，发现RBPs蛋白在PhotoCAX提取物中很好的富集（图2c）。进一步分析发现，其中有11种相关蛋白表达发生了上调，而12种蛋白发生了下调。NLPR3-RNA是其中最重要的一种相互作用，后续作者对二者的相互作用做了进一步研究，发现已报道具有富集效应的IncRNA（Malat1）在Raw264.7细胞中在LPS引入后发生上调（图3d），作者证明了该RNA可以直接与NLPR3作用，也揭示了Malat1在炎症小体激活过程中的角色。

图2. NLPR3相互作用的全转录组鉴定。

图3. 反式环状肽链的电导率实时检测。

图4. 鉴定新冠RNA-宿主蛋白相互作用。

3.      新冠RNA与宿主蛋白的相互作用

最后，作者对新冠病毒RNA在宿主细胞中的相互作用情况进行了分析。已有文章证明UTR（RNA）可以与宿主蛋白相互作用，并初始化病毒蛋白的翻译。因此，作者在HEK293细胞中表达了UTR，并用PhotoCAX方法结合生物素-凝集素相互作用提取了目标物质，如图4a所示。在这个实验中，作者分析了193个蛋白质，质谱表征筛选出了33个可以启动翻译的N蛋白多肽序列。基于上述的相互作用组，作者进一步构建了蛋白质-蛋白质关联网络辅助分析，结果也表明宿主细胞中的很多蛋白都与UTR有关联，包括核糖体蛋白、翻译因子、异质核核糖体蛋白、RNA解旋酶、真核伴侣蛋白复合体蛋白等。

【结论】

该工作发展了一种光催化生物偶联策略（PhotoCAX）用于活细胞中全局和系统研究RNA与蛋白质相互作用的机理。通过与其他技术（色谱、质谱技术）相结合，作者成功地在HEK293细胞系中发现了上千种RBPs，其中827种是新发现的。借助该方法独特的优势，作者探索了在LPS刺激后巨噬细胞的全转录组的变化以及新冠RNA在进入宿主细胞中相关蛋白质的表达情况，证明了该方法是一种鲁棒的、可以发现感染过程中病原体RNA与宿主蛋白质组相互作用的方法。