今天与大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为“A General Supramolecular Approach to Regulate Protein Functions by Cucurbit[7]uril and Unnatural Amino Acid Recognition”，这项工作由北京大学药学院刘涛课题组与南开大学化学学院刘育课题组合作完成。本文报道了一种通用的主客体识别方法，将带有客体侧链的非天然氨基酸修饰在蛋白质的功能表面，通过主体分子和竞争性客体分子对蛋白质活性进行可逆调控。

蛋白质是生命过程的关键调节因子，精确控制蛋白质的功能非常重要。基于蛋白质的分子识别如抗体-抗原相互作用、生物素-链霉亲和素结合已被广泛用于蛋白质的修饰、调节和组装。然而，一般的方法仅限于特定的蛋白质或具有特定基序的蛋白质，非常需要一种通用的分子识别方法来靶向蛋白质的结合表面，从而可逆地调节蛋白质的功能。

遗传密码子扩展技术可以在蛋白质的特点位点引入非天然氨基酸，在单残基水平精确控制蛋白质功能，但是这种调控通常是不可逆的。因此，作者尝试将蛋白质功能位点附近的氨基酸进行特异性替换（方案1），引入带有客体侧链的4-叔丁基-1-苯丙氨酸（tBuF），它可以被主体分子如葫芦[7]脲（CB[7]）特异性识别从而抑制蛋白质活性。加入竞争性底物分子后，可将主体分子从蛋白质上释放出来，从而实现对蛋白质功能的可逆调控。

方案 1  利用超分子主客体化学精确和可逆地调节蛋白质功能

首先，作者将tBuF掺入模型蛋白谷胱甘肽-S-转移酶（GST）中，来观测该主客体识别系统对酶活性的可逆控制。根据GST的晶体结构（图1a），选择底物结合口袋入口处的R108、K113和Q207三个残基作为tBuF的突变位点。在CB[7]存在下，GST-Q207tBuF突变酶（图1b）和GST-R108tBuF突变酶的活性几乎被完全抑制，而K113由于离活性位点较远而没有观察到活性的抑制。加入了CB[7]的竞争性底物FGG后，GST-Q207tBuF的活性得到有效恢复（图1b）。通过等温滴定量热法测定了CB[7]与GST-Q207tBuF和GST-R108tBuF结合的K_d值分别为4.45和24.2 μM（图1c），证明了抑制作用的确来源于CB[7]与tBuF的特异性识别结合。

图 1  主客体识别系统对GST活性的调控

接着，作者选择蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）作为下一个目标蛋白，PTP1B是一种重要的药物靶点，调控多个信号级联。作者通过晶体结构确定了R47、S118和F182作为非天然氨基酸的替换位点，并在大肠杆菌中构建了相应的突变蛋白（图2a）。在不存在CB[7]的情况，所有的突变蛋白显示出与野生型相似的活性。在1 mM CB[7]存在时，PTP1B-R47tBuF的活性被完全抑制（图2b），其他突变蛋白的活性仅受到主体分子加入的轻微影响，这与结构分析相一致，表明突变的残基中，R47最接近底物结合口袋。

图 2  主客体识别系统对PTP1B活性的调控

为了进一步证明方法的实用性，作者将其扩展到细胞因子的调节。肿瘤坏死因子α（TNFα）能够与肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）结合，通过半胱天冬酶途径诱导细胞凋亡。为了设计一种可控的TNFα，作者选择了结合表面附近的四个氨基酸残基Q21、Q25、Q31、A145突变为tBuF（图3a），在大肠杆菌BL21中重组表达获得突变型和野生型的蛋白质，并评价它们对L929细胞的细胞毒性。如图3B所示，上述四个突变体的生物活性分别为野生型的92%、97%、87%和7%。在CB[7]存在下，TNFα-Q21tBuF、TNFα-Q25tBuF、TNFα-Q31tBuF的生物活性分别被抑制27%、83%和78%。用FGG处理后，Q31和Q25突变体的活性分别恢复到87%和100%（图3b,c）。此外，在测试浓度范围内，没有观察到CB[7]和FGG的细胞毒性，证明该方法可以在活细胞上安全使用。这些结果表明，通过在功能位点附近引入tBuF，可以通过主-客体分子相互作用精确和可逆地调节TNFα的生物活性，并且原则上还可以拓展到其他细胞因子。

图 3  主客体识别系统对TNFα活性的调控

总之，本文开发了一种简单的、通用的超分子主客体相互作用方法实现蛋白质功能可逆调节。在结构信息的指导下，在每个蛋白质的选定位置引入了非天然氨基酸，其活性可以被具有高亲和力的生物相容性大环分子和竞争性客体分子可逆地调节，有望成为研究蛋白质功能的有用工具。

王可凡

黄硕课题组硕士生