今天分享一篇发表在Angew上的通讯文章。通讯作者是来自荷兰Utrecht University的Seino A. K. Jongkees，他们组主要关注遗传密码重编程、生物正交化学以及高通量体外肽展示的使用。
通过遗传密码的重编程可以有效控制蛋白的翻译后修饰。这种重编程一般需要一个带有非天然被修饰氨基酸的tRNA以及空密码子，比如使用配套的氨酰tRNA及合成酶对。也有方法是通过去除原有义密码子对应的氨基酸、加入代替氨基酸来创造空密码子、实现特定修饰的引入。但是，这些创造空密码子方法还是存在效率低下、目标肽段被截断等问题。此前，作者在尝试在体外通过AUG延长策略表达多重修饰肽的过程中发现，甲硫氨酸的类似物还会竞争起始甲酰化酶，从而产生不同的N端修饰肽混合物。这使得作者尝试通过一定优化来提高其中目标N端修饰肽的比例，从而最终帮助N端蛋白翻译后修饰的体外研究。他们计划针对细菌体外肽合成起始时的甲酰化过程进行优化。这一过程中，甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶（MTF）会利用甲酰基来源10-CHO-THF对底物进行转甲酰化反应，生成甲酰化的甲硫氨酰-tRNA（fMet-tRNAfMet），并用于起始翻译。该N末端的甲酰-甲硫氨酸（fMet）会被酶促去除，而第二位氨基酸影响了去除程度。这些过程使得作者猜测，限制MTF的底物或者破坏MTF的功能可能使得合成系统中fMet-tRNAfMet的减少，从而实现目标氨酰氨基酸的插入。
为了验证，作者使用了PURExpress商业化体外翻译系统，加入甲硫氨酸类似物（用于AUG延长）以及目标修饰氨基酸进行反应，UPLC-MS检测产物。他们发现使用去掉了10-CHO-THF的体系时的确会提高目标修饰肽产物的比例，继续增加目标修饰氨基酸会进一步提高该比例；此外，加入MTF的抑制剂甲氨蝶呤也会提高目标修饰肽比例。这些结果初步证明了对体外表达起始中甲酰化过程的抑制能够帮助N端修饰肽的合成。
他们后续注意到这个体系中仍存在去除了N端甲硫氨酸的截断肽及仅去除了甲酰基的肽；通过加入过量的起始子tRNA，截断肽的比例提高了。这说明抑制甲酰化过程还提供了另一种N端非甲硫氨酸游离肽的生产方法，不需要添加额外酶或者对第二位氨基酸的特殊选择。
作者接下来研究了这种去除10-CHO-THF来实现N酰基修饰的方案的可用范围。他们使用了N修饰有氯乙酰基、荧光素衍生物、生物素等基团的氨基酸，发现目标修饰肽有很好的产量及产物比例；由于不需要额外引入正交的tRNA及合成酶对，这种方法还有潜力应用于更多的N修饰氨基酸上。此外，他们还发现该体系也兼容带有Click反应基团的Met类似物，其产物可以后续通过Click反应方便的得到环化肽产物。
最后，作者在几种蛋白上面进行了验证，使用甲氨蝶呤抑制MTF甲酰化过程，使用生物素-苯丙氨酸为起始氨基酸、并用叠氮-同丙氨酸延长AUG密码子。通过Click反应引入荧光基团，并用链霉素亲和磁珠富集蛋白，最后的印染和荧光结果表明目标蛋白被成功合成，也进一步证明了该方法和AUG密码子延长策略的正交兼容性。总之，本文证明在细菌衍生的体外翻译系统中，移除甲酰基供体或抑制MTF酶能够帮助对N末端氨基酸的重编程，生产多种N末端修饰的蛋白。该方法能够和AUG密码子翻译延长策略以及Click反应兼容，实现对蛋白的多重修饰。
本文作者：MYZ
责任编辑：LYP
文章链接：
https://www.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202003779
文章引用：DOI：https://doi.org/10.1002/anie.202003779MYZ
目前评论：