今天与大家分享一篇发表在Angew. Chem.上的文章，文章的题目是A Biomimetic Approach for Spatially Controlled Cell Membrane Engineering Using Fusogenic Spherical Nucleic Acid。通讯作者是湖南大学的邢航教授，他目前的研究方向为无机化学、纳米医学和化学生物学的交叉领域。细胞质膜上的生物分子对细胞行为和通讯至关重要。这些分子，包括脂质、聚糖和蛋白质，彼此相互作用，以调节关键的生物学功能，如信号转导、代谢过程、癌症转移和自身免疫反应等。对细胞膜进行工程化改造为更好地研究和调控各种生命进程提供了一种有前景的策略。研究人员已经在细胞膜上成功引入了许多功能性大分子，包括蛋白质复合物、核酸和无机材料等。在这些功能性材料中，DNA由于具有高度的可编程性和生物识别特性，而被认为是可以精确控制生物界面相互作用的工具。目前，大多数研究工作都集中于细胞膜的外表面，对细胞膜内侧人工DNA能实现的功能尚待探索，有可能实现对细胞内活动的监测和调控。
图1. a) 仿生LiFT修饰策略。b) 外膜锚定DNA可用于细胞间通讯。c) 内膜锚定DNA可用于监测细胞内分子。
受到细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）融合过程的启发（细胞外囊泡可直接与受体细胞膜融合，将内容物如蛋白质、核酸、脂质等生物信息分子递送到受体细胞），作者介绍了一种基于脂质体融合的运输策略（liposome fusion-based transport，LiFT）（图1a）。设计思路是脂质体中的DNA链可以通过囊泡-细胞膜融合过程直接运输到细胞膜的外层和内层。由于作者设计的仿生囊泡结构与现有的脂质体球形核酸（spherical nucleic acid，SNA）具有相似性，DNA链主要包装在表面，因此，作者将这种具有膜融合能力的仿生囊泡命名为融合球形核酸（fusogenic spherical nucleic acid，fuso-SNA）。如图1b，1c所示，质膜的外侧和内侧都可以使用fuso-SNA轻松标记，实现细胞间通讯的调节以及细胞内代谢物的监测。
图2. fuso-SNA的制备和表征
为了获得用于LiFT的仿生囊泡，作者制备了表面加载DNA的fuso-SNA结构，基本组成是二棕榈酰-磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰-磷脂酰胆碱（DOPC）、胆固醇（chol）和二油酰-3-三甲基丙烷（DOTAP）。据报道，DPPC和DOPC与质膜上的天然磷脂酰胆碱完全兼容。DOTAP增加了仿生囊泡与细胞膜之间的静电粘附，从而促进融合。DNA链的3’末端修饰chol作为疏水锚插入脂质双层（图2a）。作者制备了fuso-SNA并利用透射电子显微镜（TEM）表征了fuso-SNA的大小和形态（图2b）。为了进一步研究fuso-SNA的表面特性，作者以没有DNA修饰的融合脂质体（bare fuso-Lipo）和有相同DNA修饰但没有DOTAP的脂质体SNA（endo-SNA）作为对照。通过使用动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和测量zeta电位来表征3种结构的表面特性（图2c）。结果显示，由于载有DNA，fuso-SNA和endo-SNA的水合直径比fuso-Lipo大。与endo-SNA相比，fuso-SNA和fuso-Lipo的zeta电位显正电，因为掺入了带正电荷的DOTAP。
图3. fuso-SNA与细胞相互作用的表征与优化
在制备了大小和DNA修饰可控的fuso-SNA之后，作者探索了fuso-SNA与哺乳动物细胞相互作用的方式。作者将HeLa细胞与fuso-SNA共孵育，其中，fuso-SNA载有Cy3标记的DNA链。随后进行细胞固定和共聚焦成像。如图3a所示，被fuso-SNA处理后，细胞膜显示红色荧光，证明Cy3标记的DNA链在膜表面固定。对照组Endo-SNA和free DNA-chol的DNA链则散布在整个细胞质中。为了对固定在细胞膜上的DNA链进行定量，作者引入了一对正交的互补寡核苷酸序列，其中一条3’端带有chol修饰，用于细胞膜的锚定，另一条带有3’Cy3修饰，与锚定链互补后可致细胞膜具有红色荧光（图3b）。通过流式细胞术，作者发现相比对照组（荧光链与锚定链非互补），实验组的荧光强度增加5倍（图3c）。作者进一步研究了不同的fuso-SNA配方对细胞膜修饰的效果。作者分别分析了DOTAP的摩尔比（图3d）、将chol替换成二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（Distearoylphosphorylethanolamine，DSPE，一种常见的、易于修饰的C-18磷脂）（图3e）。优化了fuso-SNA配方后，作者接下来对LiFT方法在膜上修饰DNA的动力学进行研究（图3f）。为了进一步证明LiFT方法对膜的修饰有效，作者将fuso-SNA与游离DNA-chol进行了比较。结果显示（图3g），10倍量的DNA-chol显示出与fuso-SNA相当的荧光。以上结果表明，LiFT是一种高效的细胞表面DNA标记策略，能够在温和条件下修饰细胞膜。
图4. fuso-SNA与细胞相互作用后脂质分子和DNA的亚细胞定位
为了进一步阐明LiFT方法的膜融合过程，作者研究了fuso-SNA与细胞相互作用后脂质分子和DNA的亚细胞定位（图4a）。SNA由Cy5、Chol共修饰的DNA链和绿色荧光团染料修饰的脂质（NBD-DSPE）制备。两个荧光基团可以研究HeLa细胞中的脂质-DNA共定位。结果显示，fuso-SNA处理细胞后，绿色脂质荧光很大程度上与质膜上的红色DNA重叠显黄色（图4b）。共聚焦3D渲染和z堆栈图像还显示不同扫描深度的细胞外围清晰的重叠荧光（图4c）。
图5. 利用LiFT将DNA链锚定在细胞膜外侧，实现对细胞间相互作用进行调控。
DNA杂交已被应用于细胞间的相互作用和通信。作者接下来通过细胞外膜锚定的DNA链来调控细胞的相互作用（图5a）。作者选择了人脐静脉内皮细胞HUVEC和CCRF-CEM细胞（一种悬浮的T淋巴母细胞）作为模型。HUVEC和CEM细胞用不同的染料染色，并与两组带有互补粘性末端的dsDNA链通过fuso-SNA融合。培养锚定了DNA的HUVEC细胞使其稳定地附着在基质上，然后与锚定了DNA的CEM细胞混合。如图5b所示，HUVEC 细胞（Dil染色，红色）沉降到底部，周围显示出经典的伪足。圆形悬浮CEM细胞（钙黄绿素染色，绿色）附着在内皮细胞上，表明通过DNA杂交可以进行细胞间相互作用。作者还观察到，当两细胞表面锚定的DNA链为非互补链时，HUVEC细胞顶部观察到很少的CEM细胞，进一步证实两种类型的细胞确实通过DNA杂交而不是非特异性附着连接。使用胰蛋白酶处理两细胞后，通过流式细胞术定量分析HUVEC和CEM细胞之间的粘附（图5c）。作者观察到在细胞表面引入互补DNA链后，HUVEC-CEM的组装在总细胞群中（HUVEC和CEM的混合物）的比例从0.52%增加到9.82%，表明组装是由DNA介导的。作者还研究了DNA介导的细胞组装在细胞间信号通路中的作用。据报道，肿瘤细胞产生血管内皮生长因子（VEGF），可诱导内皮细胞活化以释放特定的基质金属蛋白酶（MMPs）。释放的MMP降解细胞外基质，导致血管通透性增加和肿瘤转移。作为概念验证，作者计划通过互补DNA序列修饰的HUVEC和CEM细胞来模拟这一途径，诱导邻近MMP-2生产增强，通过ELISA试剂盒进行测试。如图4d所示，相比对照组，HUVEC-CEM组的MMP-2水平显著增加，表明CEM细胞刺激了附着的HUVEC细胞的活化，MMP-2的分泌增加。暗示应用LiFT方法构建具有响应信号通路的多细胞回路的潜力。
图6. 利用LiFT将适体传感器锚定在细胞膜内侧，实现了对细胞内ATP的检测
以上数据表明，fuso-SNA能够将DNA运输到细胞外表面以诱导多细胞组装并调节细胞间通讯。接下来，作者利用fuso-SNA将DNA链运输到细胞内表面并评估它们在细胞膜的内侧起作用的能力。作者将两侧负载Cy3-DNA（Cy3-DNA@OF/IF）的fuso-SNA与细胞孵育，以游离Cy3-DNA-chol链作为对照。使用DNase I进行了酶消化（图6a），DNase I是一种非特异性切割DNA的核酸内切酶。流式细胞术分析结果显示，在DNase I处理后，fuso-SNA Cy3-DNA@OF/IF细胞荧光大约有58%的保留，而游离Cy3-DNA-chol组细胞仅显示约30%的保留（图5b、c）。由于DNase I不能穿过细胞膜或脂质双层，因此只能接触和消化细胞膜外侧的寡核苷酸，而不能消化膜内侧的寡核苷酸。作者使用ATP特异性适体进行细胞膜内侧ATP的检测，已确定锚定在细胞膜内侧的DNA的功能（6d）。作者设计并构建了适体传感器，采用了标准的三链结构，由一条适体链和一对荧光基团/淬灭基团DNA链组成。作者使用末端修饰胆固醇的适体传感器来制备两种不同的fuso-SNA构建体，即，在外表面和内表面都具有适体传感器的fuso-SNA（Apt@OF/IF)，以及仅在外表面上带有适体的fuso-SNA(Apt@OF)。fuso-SNA Apt@OF/IF实验组的共聚焦结果显示细胞膜呈强烈的绿色荧光，流式细胞术显示锚定在内表面的适体传感器可以完全检测细胞质中内源性的ATP并输出信号（图5e，f）。
图7. 使用LiFT实现细胞内侧与外侧分别锚定两种不同的DNA链。
作者前面证明细胞膜外侧DNA更容易被DNase I消化。因此，利用fuso-SNAD DNA@OF/IF处理细胞，再使用DNase I去除细胞外侧DNA，随后在细胞外测重新锚定第二种类型的DNA链，作者实现了细胞膜内外侧不同的DNA修饰。从图7a中可以看出，载有FAM-DNA@OF和Cy3-DNA@IF的fuso-SNA可以使细胞膜同时具有绿色和红色荧光，产生良好的共定位荧光分布。重要的是，DNase I可以选择性地淬灭细胞膜外侧的荧光（图7a）。同样，载有Cy3-DNA@OF和FAM-DNA@IF的Fuso-SNA可以实现相同的效果（图7b）。总之，作者报告了一种基于脂质体融合的运输策略，使用fuso-SNA精确控制细胞膜外侧和内侧的修饰。结果显示，锚定在细胞膜外侧的DNA链可调节细胞相互作用和信号通路，而锚定在内侧的DNA链可以用来作为细胞内小分子的探针。这项工作为概念验证研究，为设计具有高度可控的细胞膜两侧标记方法奠定了基础，为研究细胞代谢传感、跨膜传递和细胞内催化等提供了新方法。
文章编号：126
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202111647
原文引用：10.1002/anie.202111647
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