N⁶-甲基腺苷 (m⁶A) 修饰是哺乳动物RNA中最普遍的内部修饰，在mRNA 代谢中发挥关键调节作用。目前m⁶A修饰的分析方法大都是集体水平的，导致时空和细胞间差异性信息的丢失。近日，清华大学李景虹教授团队提出了一种m⁶A特异性原位杂交介导的邻近连接分析方法 (m⁶AISH-PLA)，能够在单细胞和单分子分辨率水平下对m⁶A RNA进行成像。该工作于2021年7月21日发表在Angew. Chem. Int. Ed上，文章的题目是“Single-Cell Imaging of m⁶A Modified RNA Usingm6A-Specific In Situ Hybridization Mediated Proximity Ligation Assay(m6AISH-PLA) ”.   

m⁶A修饰是一个受去甲基化酶和甲基转移酶调控的动态过程，在基因调控中起着至关重要的作用，包括mRNA的翻译效率、稳定性和剪接。mRNA特定位点的m⁶A修饰与癌症、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病有关。然而，由于获取m⁶A位置信息的技术限制，对m⁶A功能的探索仍然具有挑战性。特别是，考虑到细胞和空间异质性，在单细胞水平上可视化和量化m⁶A RNA的能力对于理解翻译后调节和解决m⁶A甲基化相关疾病至关重要。

目前，检测RNA m⁶A修饰最常用的方法是基于高通量测序，如m⁶A特异性甲基化RNA免疫沉淀的平行化测序(m⁶A-seq) 和光敏交联偶联m⁶A测序技术(PA-m6A-seq)。这些方法可以实现对RNA中丰富的m⁶A位点的识别，但是它们的碱基分辨率能力有限并且不能定量检测m⁶A修饰片段。单碱基分辨的m⁶A分析方法目前正在发展中。然而，所有这些方法都基于从大量细胞中提取的RNA，影响了对细胞间差异性和具有生物学意义的稀有细胞群的分析，并丢失了空间定位信息。在这篇工作中，作者开发了m⁶A特异性原位杂交介导的邻近连接方法 (m⁶AISH-PLA)，允许以单分子分辨率对细胞中m⁶ARNA进行成像。这种方法利用两个邻近探针分别靶向m⁶A特异性RNA序列和m⁶A修饰，然后通过邻近连接和原位滚环扩增 (RCA) 以揭示单细胞内m⁶A RNA的空间分布。

m⁶AISH-PLA的作用机理如图所示。一条DNA链(Probe-a)与目标mRNA序列特异性杂交。另一条DNA链(Probe-b)通过生物素-链霉亲和素-生物素桥连接到m⁶A特异性抗体，m⁶A特异性抗体能够识别m⁶A修饰并与其结合。当两个探针靠近时，两个邻近探针可以用作模板，将两个额外的线性寡核苷酸(Circle-1 和Circle-2)连接到一个环状DNA分子中。然后通过RCA延伸Probe-b以产生长DNA扩增子并形成纳米线，随后通过荧光团标记的寡核苷酸的杂交进行观察。

为了研究该方法的单细胞m⁶A成像能力，作者设计了靶向HSP70基因103号位点m6A修饰的m⁶AISH-PLA探针。HSP70基因编码热休克蛋白亚基，在细胞蛋白质代谢中起重要作用。HSP70的m⁶A修饰与热休克应激反应中的选择性翻译有关。实验发现，加入探针后会观察到明显的荧光信号。然而，当不使用 probe-a或不使用m⁶A特异性抗体抗体时，几乎没有观察到荧光点，这证实了荧光信号取决于两个探针的邻近结合。此外，使用随机序列或靶向非甲基化位点的probe-a时，只有很少的荧光信号，表明m⁶AISH-PLA对识别特定的m⁶A位点具有较高的序列特异性。

最后，作者将该方法用于研究热休克对m⁶A修饰动力学的影响。研究表明，热休克后，Hepa1-6细胞中m⁶A修饰水平明显增加，并显现出明显的细胞间差异性，细胞质中m⁶A的分布比例增加。总的来说，在这项研究中，作者开发了一种称为m⁶AISH-PLA的策略，允许在RNA序列的特定位置识别m6A，并以单分子和单细胞分辨率对m6A RNA进行成像。该方法可用于研究m6A的细胞间差异和空间分布，并有望破译不同细胞过程和疾病发生的转录后功能和翻译控制机制。

【本文作者】

王玉琴

黄硕课题组博士后