化学蛋白质功能化是扩展蛋白质翻译后修饰范围的有力策略。C末端功能化因其在药物蛋白质制造和化学生物学研究中的关键作用而引起了广泛关注。与侧链和 N 端修饰反应相比，C端修饰反应相对较少，因为C端和Asp/Glu侧链羧酸盐具有相似的化学性质。肽酰胺酶 (PAM)是一种潜在的有价值的生物技术工具，因为它具有绝对的区域选择性和广泛的肽序列兼容性。作为丝氨酸水解酶，PAM选择性催化肽酰胺中C端酰胺键的水解，而不影响内部肽键和侧链。根据催化机理，水以外的亲核试剂可能会攻击肽基-PAM酯中间体以产生C端修饰的肽。为了探索这种功能化策略，作者之前通过计算蛋白质结构细化得到了工程化的稳健突变体 PAM12A，可以耐受有机溶剂，并利用乙腈中的胺修饰合成肽酰胺（图1）。然而，在水溶液中很难发生该修饰反应，除非使用肼和羟胺作为亲核试剂。因此，PAM的进一步工程化对于扩大其在水性条件下可接受的亲核试剂的范围至关重要。

在本研究中，作者设计了PAM12A的活性中心，生产突变体PAM15，其活性位点富含甘氨酸，并且可以在具有各种胺试剂的水溶液中功能化肽/蛋白质酰胺。计算分析表明，甘氨酸取代的四个残基的协同作用扩展了亲核试剂口袋。通过改善空间位阻可以显着改善丝氨酸水解酶对胺的亲核试剂偏好。预计PAM工程化将促进其在生物大分子功能化中的应用，并可能为使用丝氨酸水解酶反向催化水性条件下的酰基转移反应提供有价值的见解。

设计PAM的亲核试剂口袋

在动力学控制条件下水解酶催化的酰胺键形成主要受到酰基酶中间体的竞争性水解的限制（图S2）。由于硫酯对胺比对水更高的动力学不稳定性，Ser-to-Cys变换和随后的局部环境操作减少了由一些丝氨酸水解酶催化的酰胺键形成中的水解。受此启发，作者最初构建了PAM12A的S226C突变体，但该突变体对肽酰胺完全失活。通过直接重塑活性中心的结构，同时保留原生催化三元组，可能实现对氨解反应的偏好。

PAM12A的晶体结构揭示了三组残基，包括K123/S202/S226（催化三元组），T223/D224/D259（氧阴离子空穴）和N125/M171/T221/I254（亲核口袋）有助于活性中心结构（图2a）。因此，选择参与形成亲核试剂口袋的四个残基用于饱和诱变，以PAM12A为模板，构建突变体文库（N125X/M171X/T221X）并在大肠杆菌中表达。筛选了大约2000个转化体的细胞提取物对模型肽Ac-DFSKF-NH₂的酰肼化活性。突变体N125I/M171G对Ac-DFSKF-NH₂的合成/水解（S/H）比率增加了1.2倍（图2b），被命名为PAM13，随后被选为残基254饱和诱变的模板。用六种模型肽Ac-DFSKX-NH₂（X代表L/A/M/T/R/Y）估计了20种突变体的酰肼化活性，其中突变体PAM14(N125I/M171G/I254G)显示出增强的S/H比率（图2c）。

之后评估了亲核试剂对PAM14催化肽C末端功能化的作用（图3）。模型肽Ac-DFSKF-NH₂在1M乙二胺溶液 (pH = 9.0) 中与PAM在25°C下孵育15分钟。在PAM14的反应混合物中检测到修饰产物，而在PAM12A中没有检测到。接下来估计了烯丙胺的掺入。反应顺利进行以提供所需的产物，尽管产率较低（~20%），这表明PAM在水性条件下的亲核试剂范围可以通过重塑亲核试剂袋扩展到接受胺。之后，对更多的亲核试剂进行了PAM14催化肽C末端功能化的评估（图3）。模型肽Ac-DFSKF-NH₂首先在1M乙二胺溶液 (pH=9.0) 中与PAM在25°C下孵育15分钟。在PAM14的反应混合物中观察到修饰产物，而通过HPLC分析未检测到PAM12A的修饰活性。接下来估计了烯丙胺的掺入，反应顺利进行，以~20%产率提供所需的产物。这表明PAM可以通过扩展亲核试剂口袋至接受胺。

为了进一步提高PAM以胺类为亲核试剂的修饰效率，进行了一轮亲核试剂口袋工程。结构分析表明，PAM12A的M171和I254残基在亲核试剂口袋处形成了空间位阻，正突变体M171G和I254G似乎减少了限制可接受的亲核试剂的空间位阻（图4a）。因此推断用较小的残基替换I125和I251可能有利于胺的掺入。与PAM14相比，具有富含甘氨酸的突变体（N125G/M171G/I251G/I254G，PAM15）在乙二胺和烯丙胺作为亲核试剂的情况下，S/H比提高了3.2倍（图4b）。证明通过扩大亲核试剂口袋的空间同时保持天然亲核催化残基，可以将水溶液中PAM的亲核试剂偏好从水转换为胺。

PAM15的底物范围

有了优化的PAM15突变体，接下来研究了这种以Ac-DFSKF-NH₂作为模型肽的酶促C末端功能化反应的多功能性（图5）。发现PAM15能够催化肼、羟胺、乙二胺和氨基醇与模型肽的有效结合。PAM15还能够引入疏水基团，例如乙基、丙基和环丙基部分。2-氟乙胺和2,2-二氟乙胺作为亲核试剂大大提高了所需产物的收率。此外还测试了炔丙胺、烯丙胺和 2-氨基乙氧基胺的结合。具有炔基部分的肽的产率为96%，在生物大分子偶联和蛋白质探针合成方面表现出巨大的潜力。这些结果表明，PAM15可以为水性条件下C末端修饰肽的区域选择性制备提供广泛的功能化范围。

然后评估PAM15对肽序列兼容性（图6）。将来自两个位点饱和肽库的肽酰胺在相同条件下与PAM15和炔丙基胺一起孵育。几乎在所有肽中都观察到修饰产物，大多数所需产品的产率超过60%，这意味着大多数肽酰胺可以用PAM15以无痕方式进行功能化。对于效率相对较低的反应，可以通过提高亲核试剂浓度和pH值等手段具体改善条件。

使用PAM15进行蛋白质C端功能化

在展示了PAM15用于合成肽的C末端修饰的效用之后，接下来测试了它在肽基甘氨酸氧化酶的帮助下使重组蛋白功能化的能力(图7)。选择药物靶标NrdH-氧化还原蛋白和泛素样修饰剂 FAT10作为底物，将重组NrdH-Gly和FAT10-Gly与肽基-甘氨酸羟基化单加氧酶 (PHM)和肽基-α-羟基甘氨酸酰胺化裂解酶 (PAL)一起温育以产生相应的蛋白酰胺。

之后，在不分离中间体的情况下加入PAM15和炔丙基胺。炔基化的NrdH-氧化还原蛋白和 FAT10 通过Cu催化的叠氮化物-炔烃环加成与叠氮化物-生物素结合，最终产物总产率约为50%。酶促反应在温和条件下迅速进行（~1.5 h），且在天然蛋白质和修饰分子之间的连接处没有留下任何残留物，这表明PAM15非常有希望用于大量感兴趣的生物大分子的无痕功能化。

计算分析扩展的亲核试剂口袋

为了研究PAM12A和PAM15之间活性位点的差异，进行了加速分子动力学 (aMD)模拟和分子对接。作为一种高度稳健的酶，PAM12A在aMD模拟期间保持相当稳定，并且在全局或局部结构中没有表现出显着的构象变化。相比之下，通过引入富含甘氨酸的基序，PAM15 的活性位点显着扩大（图8）。根据已发表的量子力学/分子力学计算，炔丙基胺和 2-氨基乙氧基胺成功地对接到PAM15的亲核试剂袋中，具有有利于亲核攻击的构象。PAM12A和PAM15的叠加构象暗示PAM12A相对较小的亲核试剂袋可能无法容纳较大的胺，这与实验结果一致。因此，通过引入富含甘氨酸的基序诱导的扩大的亲核试剂袋被认为有助于更大的胺的结合，这可能解释了 PAM15 更广泛的功能化范围。