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2020年，JACS杂志上发表了题为“Site-Selective Functionalization of MethionineResidues via Photoredox Catalysis”的论文。本文的通讯作者是Merck Center for Catalysis at Princeton University主任David W. C.MacMillan教授。
蛋白质的选择性修饰仍然是一个重要的挑战，小分子蛋白偶联物作为一类新型药物的出现，激发了旨在位点选择性修饰蛋白的大量研究。迄今为止，一些策略可以直接实现内源性氨基酸的功能化。尽管该领域取得了令人瞩目的进步，但由于蛋白质结构的复杂性，选择性修饰的挑战仍很大。传统的生物正交方法依靠亲核氨基酸残基与亲电小分子之间的反应，将小分子共价连接在蛋白质的特定位点。早期生物正交方法专注于高亲核性的残基，如赖氨酸和半胱氨酸，以确保在水溶液条件下的化学选择性，然而这些反应有时难以保证修饰分布的均一性。
本文旨在开发针对其他氧化还原活性位点的光氧化还原反应。因为较强的疏水性和硫醚侧链的弱亲核性，蛋氨酸不具有传统亲核反应的优势，蛋氨酸的生物正交反应是一个特殊的挑战。但是蛋氨酸很容易氧化，可能由光氧化还原催化功能化。基于光氧化还原的策略，本文设想通过被激发的光催化剂单电子氧化硫原子，随后α位去质子化产生一个以碳为中心的α-硫自由基，这种亲核自由基物种可以与烷基化试剂反应。与其他修饰蛋氨酸硫原子的研究不同，本文提出的方法能够与相邻碳原子反应，提供稳定的结合物。
黄素催化蛋氨酸生物正交反应的机理首先是Lumiflavin光激发（λmaxabs = 444 nm）产生长寿命（τ= 20μs）的三重态激发态，这种氧化性的激发态（E1/2 red[3LF/LF−]=1.5 V vs SCE）能够和蛋氨酸的硫醚发生单电子转移反应（Epa=1.36V vs SCE）。甲硫氨酸自由基阳离子（pKa = -3.5）在lumiflavin自由基阴离子（LF-）（pKa（HLF•）=8.5）作用下产生α-硫代自由基和稳定的Lumiflavin还原形式（HLF•）。然后以亲核碳为中心的自由基中间体进行Michael受体的加成以提供α-酰基自由基。随后自由基中间体和氢原子供体（N-H键解离能=59.9 kcal/mol）之间发生氢原子转移（HAT），再生基态lumiflavin并产生蛋氨酸正交反应产物。
同时，光催化正交反应对迈克尔受体的多种官能团具有兼容性，能够引入许多与传统亲核反应不兼容的官能团抓手。本文采用含有一个蛋氨酸残基的丝氨酸蛋白酶抑制剂作为模型蛋白底物，探究了不同迈克尔受体对蛋氨酸选择性修饰生物正交反应的影响。值得注意的是，光氧化还原反应对羧酸和伯胺官能团有很好的兼容性，底物15和16分别有>95％和65％的转化率。含有炔和叠氮抓手（可用于铜催化点击化学）的乙烯基砜也能够作为蛋氨酸生物生交反应的底物，17和18的转化率分别为95％和80％。最后，带有脱硫生物素亲和标签的底物也能够成功结合，有48％的转化率。
接下来，本文评估该方法对多种不同分子量的蛋白底物的普适性和位点选择性。含一个蛋氨酸的蛋白，如泛素和α-乳清蛋白，都能够实现高转化率的生物正交反应。本文还尝试了具有多个蛋氨酸的蛋白底物的生物正交反应。反应后，首先用胰蛋白酶消解被标记的蛋白产物，然后使用液相色谱串联质谱来确定被蛋氨酸修饰的肽的相对含量。肌红蛋白是一种肌肉氧结合蛋白，具有暴露在表面的M55残基和包裹在内部的M131残基。在标准生物正交条件下，肌红蛋白烷基化转化率能够达到90％。修饰的肌红蛋白的蛋白质组学分析显示M55和M131位点的烷基化率为5：2。
最后，本文着手评估光氧化还原生物正交在生物系统中的应用，探讨这种方法是否能够在温和的条件下修饰蛋白质并不改变其三级结构。已知EGFP变性或光漂白会失活，因此蛋白的荧光水平被用来验证蛋白质功能的完整性。EGFP-炔烃正交产物容易通过CuAAC安装目标生物序列，生物素叠氮化物和九聚精氨酸叠氮化物都成功转化，形成相应的EGFP-生物素和EGFP-(Arg)9加合物。本文通过链霉亲和素免疫共沉淀验证了生物素标签和EGFP的正交反应。SJSA-1细胞被用EGFP-(Arg)9处理并使用共聚焦显微镜观察，由于九聚精氨酸肽能帮助运输蛋白进入细胞，只有EGFP-(Arg)9正交产物能够进入细胞内部。如预期的那样，在用EGFP或EGFP-炔烃正交产物处理的细胞中未观察到明显的内部荧光。这些结果突出展示光催化生物正交反应能够快速进行蛋氨酸的选择性修饰并运送生物负载进入细胞。
作者简介：David W. C. MacMillan教授，1987-1991年在University of Glasgow获得学士学位，1991-1996年在University ofCalifornia, Irvine获得博士学位，1996-1998年在Professor David A. Evans指导下在HarvardUniversity进行博士后研究，1998年7月在University of California, Berkeley开始独立研究生涯，2006年7月起在Merck Centerfor Catalysis at Princeton University担任主任，2010年7月起担任Princeton University化学系主任。
本文编辑：杨晓月 审核：张龙飞
本文链接：
https://dx.doi.org/10.1021/jacs.0c09926
本文引用：10.1021/jacs.0c09926
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