给大家推荐一篇JACS上的文章，通讯作者是东京大学Motomu Kanai.

在活细胞内引入蛋白质翻译后修饰(PTMs)的选择性方法已被证明对研究其生物学功能有价值。与酶的方法相反，非生物催化应该提供多样化和新的到自然的PTMs。在这里，我们报道了硼酸盐辅助羟肟酸(BAHA)催化剂体系，它包括一个蛋白质配体，一个羟肟酸路易斯碱和一个二醇部分。在配合一个含硼酸酰基供体，我们的催化剂利用局部摩尔浓度效应促进酰基转移到目标赖氨酸残基。我们的催化剂系统采用微摩尔试剂浓度，并提供最小的脱靶蛋白反应性。关键的是，BAHA对谷胱甘肽具有抗性，谷胱甘肽是一种代谢产物，它阻碍了许多在活细胞内进行非生物化学的努力。为了展示这种方法，我们在人类细胞表达的大肠杆菌二氢叶酸还原酶中安装了各种酰基。我们的结果进一步建立了众所周知的硼酸二醇络合作为一个真正的生物正交反应，应用于化学生物学和细胞内催化。

使用DSH催化剂体系进行区域选择性蛋白赖氨酸酰化(图1a)，然而，当这种催化剂在活细胞中使用时，高浓度的细胞内硫醇，如谷胱甘肽(GSH，约5 mM)导致关键的硫酯中间体猝灭。因此，需要用谷胱甘肽生物合成抑制剂和毫米波浓度的硫酯试剂来处理细胞以获得高产量。为了克服这个问题，我们在此报道了硼酸盐辅助羟肟酸(BAHA)催化(图1b)。在这个设计中，二醇模块可逆地结合到含硼酸的酰基供体形成硼酸酯。随后的分子内酰基转移到路易斯碱，因此受益于局部的摩尔浓度效应，导致反应中间体更快速的生成，即使在微摩尔试剂浓度。明智地选择含硼酸的酰基供体和二醇模块导致了优化的催化剂体系，使各种功能化酰基能够高产地安装到活细胞内感兴趣的蛋白质中。

在研究的候选供体中，D1最有前途，因为它在酰胺化反应中比硫酯形成的反应更优先然后在供体D1上添加一个硼酸基团来提供供体D2(图2)。在研究的候选供体中，D1最有前途，因为它在酰胺化反应中比硫酯形成的反应更优先，然后我在供体D1上添加一个硼酸基团来提供供体D2(图2)，为了确定合适的催化剂结构，合成了模型底物，它通过柔性连接物与赖氨酸残基和二醇部分共价连接。用HPLC检测了D2存在下这些底物的赖氨酸乙酰化(图2a)。在使用底物3进行的不同乙酰给体浓度的实验中，反应表现出饱和动力学(图2b)。

有了这些信息，我们合成了催化剂6，它配备了三甲氧苄啶(TMP)，一种大肠杆菌二氢叶酸还原酶(eDHFR)的配体(图3)。eDHFR-GFP在6和D2存在下的试管反应证明是成功的。采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)计算乙酰化率，所有试验均检测到最接近催化剂结合位点的单个赖氨酸残基(K32)的乙酰化。进一步反应容忍各种潜在的抑制剂,包括5毫米谷胱甘肽(B),海拉胞浆提取(C)、多巴胺(D),果糖(E),和20枚反应副产物(F)。我们注意到反应容忍亚化学计量的催化剂装入(20 mol %),这是罕见的蛋白质化学改性。

5 μM 6和100 μM D2在5小时后的转化率只有22%(图4a)。考虑到催化剂的高亲水性和分子量可能会损害其药代动力学方面，如膜的渗透性和/或代谢稳定性，合成了催化剂7(图4)，它更亲脂，并具有简化的连接结构。另一方面，改变苯环的连通性，从对位到间位可以得到我们优化的催化剂8(80%，图4)。值得注意的是，观察到催化剂8在1 μM负载下表现出最大产率的钩剂量响应曲线(图4b)，这与由蛋白质、催化剂和乙酰给体组成的三元络合物的形成相一致。接下来，评估了优化后的催化剂体系的蛋白质选择性(图4c)。用催化剂和乙酰供体处理表达eDHFR-GFP的HEK293T细胞。然后对细胞进行裂解，并用Western blotting检测含有乙酰赖氨酸的蛋白。BAHA催化剂体系(列2和3)产生了清晰可见的产物带，没有检测到脱靶乙酰化。转染空载体(lane 4)或eDHFR-GFP K32R(lane 5)导致产物带丢失，从而确认了反应的蛋白和位点选择性重要的是，我们之前发表的DSH体系在优化条件下(25 μM DSH和10 mM硫酯乙酰基供体)的目标乙酰化率只有22%，而BAHA体系(1 μM 8和100 μM D4)的目标乙酰化率为82%(图4b)。

检测了BAHA系统介导的赖氨酸酰化在HEK293T细胞中的酰基供体范围(图5)。内源性PTMs乙酰基(D4;82%)32和丁基(D5;79%)。含炔烃(D6;叠氮化物(D7;72%)反应处理也有很高的产量。此外，具有光反应性的二氮齐林基团的供体(D8;69%)。蛋氨酸作为蛋白质修饰的靶点越来越有吸引力;含硫醚供体(D9)的33,34酰化反应的产率为63%。链霉亲和素结合去硫生物素部分的安装也成功了(D10;62%的收益率)。安装氟(D11;49%)和含酰基的低聚乙二醇(D12 52%)也是可能的，但需要较高的酰基供体量才能获得合理的产量。含有带电官能基的酰基供体不成功，可能是由于膜通透性低。另一方面，带电酰基供体的不稳定保护组允许部分安装含羧酸盐和膦酸盐的酰基(D13−14)。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c07060.

原文引用：10.1021/jacs.1c07060.