ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES|适体导向的活细胞膜上糖蛋白修饰

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介绍一篇 2020 年发表在ACS Appl. Mater. Inter.的文章,题目为 “Aptamer-directed Protein-specific Multiple Modifications of Membrane Glycoproteins on Living Cells” 。该工作使用适体指导的生物正交反应对目标蛋白进行特定的多重修饰,从而进行多色成像和细胞表面纳米工程,增强对细胞活性的全面理解,为鉴定及治疗靶标提供了新的机会。       湖南大学的蒋健晖教授和谭蔚泓教授站介绍 http://www.tanhnugroup.com/。蒋健晖课题组的主要研究方向为生物传感和生物成像,主要涉及生物大分子与细胞半合成及生物成像、生物传感技术与芯片等研究;谭蔚泓课题组的研究方向为生物分析、分子工程和DNA纳米技术以及生物传感器。

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【背景介绍】

细胞上的膜蛋白在细胞活动中发挥着重要作用,例如细胞间的通讯、细胞增殖和迁移。 因此,了解这些蛋白质的功能方式已成为细胞生物学的主要目标。活细胞表面膜蛋白特定位点上插入功能标签,有助于理解蛋白在天然环境中的功能。遗传技术已允许对目标蛋白中的非天然功能性氨基酸进行编码,以便在特定位点进行精确修饰,从而对原始蛋白结构、构象变化和途径追踪进行系统研究。然而,遗传编码过程需要繁琐的人工氨基酸合成和选择,以及费时的表达工程。对于非遗传编码的脂质和聚糖结构,在特定位点进行功能化修饰更加困难

在非遗传编码特定的蛋白质标记方面,生物正交反应可与目标官能团进行选择性反应,在较短的反应时间实现较高的产率。抗体和凝集素的生物正交反应已实现了分子水平的选择性但是,该过程仍然需要大量劳动力,而且存在通量低等问题。最重要的是,这些靶向基序可以在一定程度上阻断靶位点,从而影响进一步的靶向活性,甚至可以改变蛋白质的功能。与需要复杂合成和修饰的抗体工程相比,适体具有高度特异性的靶标亲和力,可重现的结构,容易化学修饰以及较高的热化学稳定性,可以潜在地解决这一问题。


【设计原理】

   作者用N-叠氮乙酰基甘露糖胺四酰(Ac4ManNAz)孵育细胞,将N-叠氮基乙酰神经氨酸(SiaNAz)诱导到细胞膜表面的糖蛋白。然后使细胞与通过工程改造带有环辛炔基团和功能分子的DNA适体链反应。适体结合后,环辛炔优先与目标蛋白上的叠氮化物部分反应。为了在反应后去除DNA链,在适体和功能分子之间插入一个光裂解(PC)间隔子。在紫外光照射下,PC间隔子将共价结合转变为非共价结合,从而能够用cDNA洗涤去除适体,使得只有功能分子被保留在靶蛋白上。通过重复此过程,可对活细胞上的同一糖蛋白进行多种修饰。

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1. 适体导向的蛋白质特异性生物正交修饰


【数据介绍】

代谢细胞上键联DNA探针的结合特性表征:PC间隔子是转导探针和蛋白共价或者非共价连接的关键。作者增加辐射时间,观察到FTDO5-PD的荧光位移逐渐接近细胞峰,8分钟后无明显减少,即表明8分钟365 nm紫外线照射足以切割PC间隔。紫外线照射和cDNA洗涤后,FTDO5-PD的荧光位移恢复到荧光状态,但TDO5-PFD探针几乎没有变化(图2A)

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2.  代谢细胞上键联不同DNA链的结合表征及DFPDPF化学结构


代谢的细胞与不同探针的共聚焦成像作者合成了DNA 探针TDO5-P3D和TDO5-P5D,其中3和5代表Cy3和Cy5荧光团。在既定的反应条件下,预处理的Ramos细胞和TDO5-P3D探针孵育,然后用紫外光照射一半细胞cDNA洗涤两个样品。共聚焦成像表明具有紫外辐射组可观察到Cy3Cy5和FRET信号,但对照组只看到Cy3荧光,没有FRET信号(图3A a-b)。相同的结果CEM细胞和Sgc8c-P3D/Sgc8c-P5D 也被观察到3A c-d)。Cy3、Cy5和FRET信号的定量分析证明了紫外辐照是Cy3和Cy5染料标记的关键过程3B。该方法能有效地去除适配体残基,释放目标位点,用于下一次识别为同一目标蛋白多次修饰提供工具。

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图3. 代谢的细胞与不同探针的共聚焦成像实验


为了证明这种修饰是由生物素链霉亲和素反应引发的,作者合成反应后去除生物素的TDO5-BPD DNA探针,没有荧光是用量子点染色后留下的(图4A a-b)。当Sgc8c-PBD和Sgc8c-BPD与Ac4ManNAz预处理的CEM细胞反应时观察到类似的结果(图4A c-d)。各组荧光定量,结果均显示出适体PBD组与适体BPD组显著性差异(图4B)

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4 DNA修饰是由生物素链霉亲和素反应引发实验


【总结】

作者设计了一种新的化学方法,利用适体结合用于多色蛋白质成像和细胞的特殊蛋白质上的多功能分子膜研究。与现有的方法相比,该方法具有较高的选择性,并可对蛋白质及其它靶点进行多次修饰调控蛋白质及生物分子,为细胞修饰工程提供工具。

 

撰稿人孙淼(博士生)  万霜(硕士生)

校稿:宋佳

原文链接https://doi.org/10.1021/acsami.0c07004


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