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英文原题：Photoswitchable Isoprenoid Lipids Enable Optical Control of Peptide Lipidation
通讯作者：Christine A. Hrycyna 教授，美国普渡大学；Mark D. Distefano 教授，美国明尼苏达大学 供稿人：马毅骢，北京大学 大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“Photoswitchable Isoprenoid Lipids Enable Optical Control of Peptide Lipidation”，文章的通讯作者分别是来自普渡大学的 Christine A. Hrycyna 教授、来自纽约大学的 Dirk H. Trauner 教授和来自明尼苏达大学的 Mark D. Distefano 教授。在这项工作中，作者团队基于偶氮苯在 365nm 与 460nm 波长的光照下可发生顺反异构变化的特点，设计了接有偶氮苯的法尼基二磷酸类似物（AzoFPP-1）。AzoFPP-1 可作为法尼基转移酶（FTase）的底物对携带 CaaX 基序的蛋白质进行异戊烯酰化修饰，进而赋予下游蛋白特定的生理功能。实验结果表明，AzoFPP-1 可在蓝光照射下处于反式构象，并表现出与 FTase 的高亲和力。接着，仅反式构象的AzoFPP-1 能被成功修饰到酿酒酵母（Saccharomyces）交配信息素 ⍺ 因子的末端进而激活其抑制酵母生长的功能。本工作将可光致异构的偶氮苯的应用扩展至异戊二烯这类对生物功能极为重要的脂质中，并实现了光控、可逆的蛋白脂化过程，这对相关信号通路的研究有非凡价值。
图1. 携带可光致异构的偶氮苯的法尼基二磷酸可用于调控法尼基转移酶的活性 在蛋白质的翻译后修饰中，异戊烯酰化修饰是最常见的类型之一。此类修饰可在转移酶的帮助下为蛋白质连接 3 或 4 个异戊二烯单元，分别形成法尼基化或香叶酰香叶酰化修饰。这些基团常通过目标蛋白 C 端的半胱氨酸残基进行连接，并在 Ste24 或 RCE1 蛋白酶的帮助下使目标蛋白 C 端发生三氨基酸的酶切，最终由 ICMT 甲基转移酶将 C 端暴露的半胱氨酸羧基进行甲基化修饰。经过上述翻译后修饰步骤，目标蛋白的亚细胞定位与蛋白-蛋白相互作用会发生生理性变化。在之前的工作中，已有团队实现了光诱导的 FTase 抑制来调控目标蛋白的异戊烯酰化调控，但这种手段无法实现酶的激活，且是不可逆的。因此，作者团队设计、合成了可光致异构的 AzoFPP-1，以及与其有相似活性但更加稳定的 AzoFPP-2。作者预期使用 365nm 波长的紫外光照射 AzoFPP 时，可使该物质处于顺式构象，而使用 460nm 波长的蓝光照射 AzoFPP 时，可使该物质处于反式构象。（图 2）。
图2. 光控的法尼基二磷酸类似物的设计与目标蛋白异戊烯酰化修饰的过程
接着，作者使用如图 3 所示的合成路线，制备了 AzoFPP-1 与 AzoFPP-2。在紫外-可见光光谱分析中，两种 AzoFPP 分子都表现出与原始的偶氮苯相似的可光致异构性，并且分子的构象变化也得到了 HPLC 分析的验证。值得注意的是，AzoFPP 进入顺式构象后可在蓝光的循环照射下恢复反式构象，而这一恢复过程在 37°C 的溶液环境中也可自发进行，但需要较长时间（50～60 小时左右）。考虑到 AzoFPP-1 与 AzoFPP-2 有相似的光学异构性能，作者团队在后续研究中使用了与天然产物更为类似的 AzoFPP-1 作为研究对象。在分子对接模拟测试中，AzoFPP-1 的反式构象表现出相比顺式构象更好的 FTase 酶活口袋适应性，且顺式构象的 AzoFPP-1 与活性口袋中的亮氨酸有可见的位阻冲突，这暗示 AzoFPP-1 经紫外光照射后的顺式构象可抑制 FTase 酶促反应活性（图 3）。
图3. AzoFPP 的合成方式、光控顺反异构的实验流程以及分子对接模拟的结构示意图
之后，作者使用体外的酶促反应实验来验证 AzoFPP-1 是否能用于光控的下游蛋白异戊烯酰化修饰过程。使用 LC-MS 对反应进行监测后，作者发现在不添加酶的体系中，天然 FPP 无法连接至目标蛋白 ⍺ 因子上，并在 27.9 min 时出峰；而在添加 FTase 后，产物会在 58.8 min 时出峰，这表明目标蛋白异戊烯酰化修饰的发生。更重要的是，当作者使用 AzoFPP-1 进行实验时，使用紫外光照射反应体系后，带有异戊烯酰化修饰的产物峰会在 LC-MS 谱图中消失，且实验组相比对照组能有 5 倍以上的产物量变化。这直接证明了使用 AzoFFP-1 与光照来控制 ⍺ 因子异戊烯酰化修饰的可行性 （图 4）。
图4. 光控的目标蛋白异戊烯酰化修饰过程
确认 AzoFPP-1 在光控目标蛋白修饰中的可行性后，作者团队进一步验证偶氮苯的加入是否会影响目标蛋白后续的酶切、甲基化修饰过程，以及最终产物是否有生物活性。为此，作者通过化学手段合成出一系列 ⍺ 因子在被异戊烯酰化修饰后分别经历酶切、甲基化修饰的中间、最终产物，并与它们对应的酶共孵育，最后观察这些携带偶氮苯的底物是否能被酶正确识别、处理。实验结果表明，向法尼基中引入偶氮苯不会影响目标蛋白后续的酶促反应，且 AzoFPP 此时的顺反构象不会对酶促反应效率有显著影响。经过重重修饰后的 ⍺ 因子也在酵母生长抑制实验中表现出预期的生物学功能（图 5）。
图5. 目标蛋白异戊烯酰化后的下游修饰过程
综上，作者利用偶氮苯作为 FPP 底物的光控开关，成功赋予了 AzoFPP 的可光致顺反异构能力，并发现仅反式构象的 AzoFPP 可被 FTase 高效识别并用于目标蛋白的异戊烯酰化修饰。最后，作者将这一光控系统应用于酵母信息素 ⍺ 因子的修饰调控中，实现光控的酶促反应激活，以及 ⍺ 因子生理功能的激活。这项工作拓展了偶氮苯在脂类分子中的应用，对于以脂质作为信号分子的通路研究以及成药研究提供了新的潜力和新的视角。
ACS Chem. Biol. 2022, ASAP Publication Date: October 4, 2022 https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00645 Copyright © 2022 American Chemical Society
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