分享一篇发表于JACS的文章，Enzymatic Modification of N‑Terminal Proline Residues Using Phenol Derivatives. 本文的通讯作者是加州伯克利大学Matthew B. Francis。Matthew B. Francis教授发展了许多蛋白质修饰的方法并将其应用于蛋白质递送。

蛋白质位点特异性修饰对于蛋白质的性质改善及应用具有十分重要的意义。本文作者在前期发展了一系列蛋白质N-端特异性偶联的方法，特别是基于氨基苯酚和儿茶酚的衍生物氧化后与脯氨酸的偶联（图1a）。但是这类反应需要加入大大过量的氧化剂，且底物一般现制备现用，使偶联反应变得繁琐。文献报道，黑色素合成过程中酪氨酸酶催化反应产生的中间体也是醌类衍生物（图1b），因此作者设想利用酪氨酸酶催化苯酚或者儿茶酚衍生物与蛋白质N-端脯氨酸的偶联。

图1. (a) 氧化偶联反应；(b) 黑色素合成过程中酪氨酸酶催化的反应

如图2所示，作者首先利用N-端带有脯氨酸的sfGFP与苯酚的小分子衍生物在酪氨酸酶的催化下尝试了模型反应。室温条件下，只需要10当量的小分子和0.008当量甚至更低当量的酪氨酸酶，就能够实现小分子与蛋白质N-端脯氨酸的偶联（图2）。该偶联反应通过蛋白质N-端氨基酸改变和胰酶降解后的质朴表征，确认其偶联发生在蛋白质N-端的脯氨酸。但是，偶联产物中有非常少量的产物修饰有两个苯酚小分子衍生物，作者猜想可能是与赖氨酸的氨基等基团发生了反应，不过作者没有得到足够的产物进一步表征，并且可通过降低反应时的温度抑制该副反应。

图2. 酪氨酸酶催化的蛋白质N-端特异性偶联

作者而后利用可商业化买到的生物素活性酯与酪胺反应，得到苯酚的生物素偶联物（1a），在酪氨酸酶的催化下实现蛋白质N-端的生物素化（图3）。同样，该反应在10当量的1a和0.008当量的酪氨酸酶的条件下室温30 min就能够实现90%以上的转化率，但0.2当量的酪氨酸酶才能够达到百分之百的转化率。作者随后又筛选了其他条件对该反应的影响，包括pH (5~9)、温度（4 ℃，室温，37 ℃）。该反应在低于pH6.5时转化率会大大降低，作者发现，低pH不会影响酪氨酸酶的催化，可能是由于脯氨酸的N在低pH条件下发生了质子化，影响了该反应的进行。温度对于该反应的影响则主要体现在对蛋白的二修饰上。温度越高，两分子修饰的比例会逐渐提高，37 ℃只需反应15 min就会出现两分子修饰，而4 ℃反应2 h，两分子生物素修饰的蛋白质比例低于10%。

图3. 酪氨酸酶催化的蛋白质N-端生物素化

为了进一步验证该偶联反应形成产物的稳定性，作者分别尝试了不同温度（4~37 ℃）、不同pH （5~9）以及10 mM其他亲核试剂（例如精氨酸的胍基、赖氨酸的氨基等）存在下产物在24小时内的稳定性。在这些条件下产物在24小时内均可以保持稳定，只有在GSH、BME、L-Cys等含游离巯基小分子存在的情况下，该产物有所降解(∼10% for L-cys and GSH, and∼20% for BME)。

作者进一步探索了该反应的蛋白适用性。作者利用自己构建表达N-端为脯氨酸的烟草花叶病毒(TMV)衣壳蛋白、MS2病毒衣壳蛋白以及商业化的肌氨酸磷酸激酶(CPK)、醛缩酶(ALD) (这两种蛋白的N端均为脯氨酸)与1a在酪氨酸酶的催化下，4℃反应2 h均可完全转化。

图4. 酪氨酸酶催化的蛋白质N-端特异性修饰

最后作者将生物素替换为不同的荧光分子，在酪氨酸酶的催化下与几丁质结合蛋白进行偶联，偶联反应在4℃，0.2当量的酪氨酸酶的条件下反应2 h均可实现较高的转化率，并且荧光分子修饰后不影响几丁质结合蛋白与酵母或者致病性真菌表面的几丁质的结合。

总而言之，本文作者主要利用酪氨酸酶实现了苯酚衍生物与蛋白质N-端脯氨酸的特异性偶联，高效快速，条件温和，进一步拓宽了蛋白质修饰的方法。

DOI: 10.1021/jacs.8b10845

Link: https://pubs.acs.org.ccindex.cn/doi/10.1021/jacs.8b10845