分享一篇发表在ACS Appl. Mater. Interfaces上的文章，题为：Aptamer-Directed Protein-Specific Multiple Modifications of Membrane Glycoproteins on Living Cells。本文的通讯作者是来自湖南大学的蒋健晖教授和谭蔚泓教授。

细胞膜蛋白在许多细胞活动中都起着重要的作用，例如细胞间通讯、细胞增殖和细胞迁移等。因此，了解这些蛋白质是如何运作的已经成为了细胞生物学上至关重要的目标。目前，遗传技术已经实现在目标蛋白质上插入非天然功能性氨基酸，以便在特定位点进行精确修饰，从而对蛋白质结构、构象的变化和追踪途径进行系统的研究。然而，编程需要耗费大量的人力和时间，包括在氨基酸合成、选择以及表达工程上，并且对于非遗传编码的部分(例如脂质体和聚糖结构)来说更为复杂。

除此以外，选择性高、反应时间短、反应产率高的生物正交反应也为特定的蛋白质标记提供了优势，但这个过程仍需要复杂的工程来实现。研究人员还尝试通过生物正交反应将抗体和凝集素进行偶联，以实现在分子水平的选择性，或是将遗传和代谢技术与生物正交反应对结合，然而这些方法依旧费时费力，且需要复杂的分子设计和工程优化来避免蛋白质功能的缺失。因此，目前迫切需要一种简便的方法来对特定蛋白进行多重修饰。

为了实现这一目标，本文作者将适体定向的生物正交反应用于目标蛋白上不同分子的偶联，从而进行多色成像和细胞表面纳米工程，让人们对细胞活性有更加全面的了解。整个过程如图1所示，适体就像是一颗子弹，将功能分子和二苯并环辛基引导至标记有叠氮化物的特定糖蛋白上，并进行共价结合。接着，为了方便反应后去除DNA链，作者在适体和功能分子之间插入一个光可切割(PC)的间隔子，然后通过紫外照射和cDNA洗涤进行适体杂交，将共价键转变成非共价键。最后，只有成功在目标糖蛋白上标记的功能基团能保留下来。

图1.适体诱导的蛋白质特异性生物正交修饰技术，将功能分子传递并标记到特定蛋白质上。

作者基于之前的研究，确定了TD05和Sgc8c这两种适体作为模型，分别靶向Ramos细胞上的膜糖蛋白B细胞受体(BCR)和人急性淋巴细胞白血病(CEM)细胞上的酪氨酸激酶7(PTK7)，通过将二苯并环辛基(D)一个接一个地连接到5'端，合成由TD05适体(P)和FITC荧光团(F)组成的TD05-PFD DNA链(图2B)。为了优化紫外光照射时间，作者还合成了在3'端带有FITC荧光团的FTDO5-PD DNA探针。通过增加紫外照射时间，作者观察到FTD05-PD的荧光位移逐渐接近纯细胞峰，并且在8分钟后没有进一步下降，这表明365 nm UV辐照8分钟足以裂解PC间隔物。这个策略对CEM细胞同样有效，表明该方法有望成为将功能分子定向传递并结合到糖蛋白上的通用方法(图2A)。

图2. A) 不同DNA链对代谢细胞的结合测试。B) DFP和DP的详细化学结构。

因为适配体在反应后会被释放，所以该修饰过程对于靶蛋白的多重修饰应该是可重复的。作者合成了DNA探针TD05-P3D(含Cy3荧光团)和TD05-P5D(含Cy5荧光团)。从图3A中可以看到，Cy3和Cy5荧光信号以及FRET均能在样品a(用紫外光照射)中观察到，但样品b中仅能观察到Cy3荧光，却未见FRET信号，表明适体残基可以进一步阻止靶点活性。在相同条件下将Sgc8cP3D/Sgc8cP5D应用于CEM细胞时也观察到了相同的结果 (图3A(c，d)) 。对Cy3、Cy5荧光和FRET信号的定量分析也证明了紫外照射是制备CEM细胞的关键过程(图3B)。因此，本文的方法可以有效地去除适配体残基以释放目标位点，并进行下一步识别。这允许其对同一目标蛋白进行多种修饰，从而进行多色成像或分子工程。

图3.  A) 在标准条件下在代谢细胞上修饰的不同DNA链的CLSM图像。a) Ramos细胞，进行紫外线照射；b) 不使用紫外照射；c&d) CEM细胞。B)定量荧光分析。

综上所述，本文作者设计了一种新的化学方法，该方法使用适配体将特定蛋白质上的多个功能分子偶联在一起，以进行多色蛋白质成像和细胞膜纳米工程，为确定治疗靶点提供了新的机会。

作者: HYH 审校: LJH

DOI: 10.1021/acsami.0c07004

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.0c07004