分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章，文章题目是“Phosphorothioate-Based Site-Specific Labeling of Large RNAs for Structural and Dynamic Studies”，本文通讯作者是来自清华大学生命科学学院的Xianyang Fang教授，他们课题组的研究方向主要是非编码RNA的整合结构生物学。

RNA在许多细胞过程中发挥重要作用，RNA功能多样性来源于它们形成不同三维(3D)结构的能力和构象变化。了解RNA的结构、相互作用和构象动力学对于理解其功能和开发基于RNA或靶点RNA的治疗药物至关重要。由于RNA的柔性，通过X射线晶体衍射和冷冻电镜等技术对RNA进行结构分析具有很大挑战性。利用综合方法来表征RNA的结构、相互作用和构象动力学是该领域的一个发展趋势，综合方法将不同分辨率的实验数据和多种技术与计算建模相结合。在这些技术中，脉冲电子-电子双共振(PELDOR)光谱、X射线散射干涉(XSI)和单分子荧光共振能量转移(smFRET)是测量分子内或分子间距离的分子标尺。生物分子分别用自旋探针，金纳米颗粒(AuNPs)和荧光团进行位点特异性标记，就可以测量纳米范围内或分子间的距离分布，但是目前这些标记方法难以实现长链RNA的标记。近来，长链RNA (高达700nt)的位点特异性标记已经通过非天然碱基对(UBP)系统的转录和点击化学或胺-NHS酯反应的转录后修饰的组合来实现。UBPs的功能修饰主要在碱基上引入，由于所使用的功能基团或标记探针的大小，可能会导致修饰RNA的结构扰动，降低距离测量的准确性。本文作者合成了rTPT3TP (rTPT3αS)的α-硫代磷酸化变体，其可以通过马来酰亚胺修饰的探针在内部α-磷酸骨架上对长链RNA进行转录后特异性标记。

硫代磷酸（PS）是核酸（DNA/RNA）上的一种修饰，硫原子取代了磷酸酯骨架中的一个非桥接的氧原子，PS修饰提供了亲核位点，可以利用含有碘乙酰胺或马来酰亚胺的标签进行烷基化，已有研究应用此修饰将功能基团如AuNPs和蛋白质精确地组装在PS修饰的DNA序列上，但是在RNA上目前还没有应用。这种骨架上的单原子取代相比于碱基官能团化对核酸结构的扰动较小，并且不涉及碱基配对，作者希望将该反应应用于长链RNA的结构和动力学研究中。作者首先合成了rTPT3TP的α-硫代磷酸化变体（硫代磷酸核糖核苷酸TPT3三磷酸，rTPT3αSTP），并对RNA和标记位点的选择性进行测试。通过将NaM-TPT3 非天然碱基对系统和硫醇-马来酰亚胺反应相结合，以特异性方式分别将马来酰亚胺自旋探针、AuNPs和荧光团共价连接到长链RNA的PS骨架中。标记的RNA分别通过小角X射线散射（SAXS）和NRase P的酶活实验对其结构和功能进行测试，散射谱和酶活结果显示PS骨架修饰对RNA结构和功能造成的扰动小，之后作者通过PELDOR、XSI和smFRET等测量方法对酶的距离和构象动力学进行测试，与基于核苷酸碱基的共价标记方法相比，PS骨架修饰距离分布更窄，可以提高距离分布测量的准确性。

总而言之，本文介绍了一种基于磷硫酰化的长链RNA位点特异性修饰策略，降低了RNA标记对结构和功能的干扰。