分享一篇发表在Cell Chem. Biol.上的文章，题目为Specificity profiling of deubiquitylases against endogenously generated ubiquitin-protein conjugates。本文通讯作者为哈佛医学院的Randall W. King教授。King课题组致力于揭示泛素-蛋白酶体系统在细胞分裂过程中的作用。

去泛素化酶（DUBs）能清除蛋白质的泛素化修饰，从而调节蛋白质的稳定性或活性。人类基因组中编码的DUBs约有100种，根据其作用机制分为两大类：一大类是半胱氨酸蛋白酶，一小类是锌依赖金属蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶DUB又进一步细分为几个家族，包括 UCH、USP、OTU、MINDY、MJD和ZUFSP。USP家族是最大的家族，包含56个DUBs。目前，研究人员对DUB-底物的特异性了解很有限，因为缺乏针对生理底物比较不同DUBs的研究方法。在此前工作中，King课题组发展了乙烯基砜修饰的泛素（UbVS），进而实现了半胱氨酸蛋白酶DUBs的广谱性抑制。在本文中，研究人员使用内源的泛素组作为底物，系统研究了30个DUBs的底物选择性。

首先，作者将爪蟾卵提取物与UbVS共孵育，以抑制内源的DUBs。随后，将单个重组人DUB（800 nM）与 HA修饰泛素一起加入并孵育。HA-泛素-蛋白偶联物经免疫纯化，并通过基于TMT的定量蛋白质组学方法进行表征。上述流程能够稳定鉴定到968个泛素化修饰蛋白，其中374个蛋白是所测试DUBs的潜在底物。作者发现了五种高影响DUBs（USP7、USP9X、USP36、USP15和USP24），每种DUBs都能减少10%以上分离蛋白的泛素化。对泛素组中蛋白功能进行聚类，结果表明中心体蛋白和异质性核蛋白（HNRNPs）对DUBs高度敏感；而代谢酶、蛋白酶/肽酶、tRNA 合成酶和UB/UBL E1酶对DUB几乎完全不敏感。

在374个潜在底物中，124个（33%）仅被单一DUB切割，而93个底物能够被超过5个DUBs切割，表现出差异的底物特异性。高影响DUB的候选底物显示出大量重叠，并且富含无序区域，这表明这一特征可能会促进底物识别。其他DUBs显示出较低的影响和非重叠特异性，它们以不同的非无序蛋白为靶标，包括核糖体或蛋白酶体等复合物。