英文原题：Efficient Enzymatic Incorporation of Dehydroalanine Based on SAMDI-Assisted Identification of Optimized Tags for OspF/SpvC
通讯作者：黄胜友, 华中科技大学; Milan Mrksich, 美国西北大学; 冯欣欣, 湖南大学大家好，本期为大家分享一篇发表在ACS chemical biology上的文章，文章题目为“Efficient Enzymatic Incorporation of Dehydroalanine Based on SAMDI-Assisted Identification of Optimized Tags for OspF/SpvC”，文章的通讯作者是华中科技大学的黄胜友教授、美国西北大学的Milan Mrksich教授和湖南大学的冯欣欣教授。本文中，作者对OspF/SpvC的单磷酸化底物进行筛选，得到了能够被OspF/SpvC催化的单磷酸化多肽标签，实现了Dha/Dhb的酶促反应引入，并借助该策略成功对蛋白和细菌进行了标记。
蛋白质位点特异性修饰能拓展蛋白质结构和功能多样性，在生化研究和疾病治疗等领域应用广泛。目前的标记策略可以分为两大类，第一类是非反应性标签标记，包括生物素化，酯基化标签等，第二类是反应性标签标记，例如叠氮，炔基，四嗪等标签，可以利用它们进行下一步的偶联修饰。然而，这些反应性的标签通常会引入比氨基酸本身更大的“连结疤痕”，不利于蛋白的精确功能化改造。
脱氢丙氨酸 (Dha)或脱氢丁氨酸 (Dhb)可以用于蛋白质的无痕偶联修饰，目前已成功应用于糖基化，磷酸化等多种翻译后修饰的人工引入。目前将Dha插入蛋白质的策略一般是先引入Dha的前体(例如SeCys, pSer, FSY等)，再经过一步化学反应得到Dha。相比于化学反应，利用酶促反应引入蛋白修饰更加温和，也更接近自然界本身存在的各种翻译后修饰过程，但目前尚未报导过基于酶促反应的高效Dha插入技术。
作者们想从磷酸裂解酶OspF和SpvC出发，开发一种高效的Dha酶促插入技术，将其应用于蛋白质特异性标记。OspF 和 SpvC，分别由福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌分泌，可识别磷酸化激酶上的pT/pS-X-pY 基序，在催化作用下使得磷酸化苏氨酸（pThr）或磷酸化丝氨酸（pSer）发生αβ-消除反应生成Dhb或Dha。然而这种双磷酸化的识别序列不利于将Dha/Dhb高效特异地引入到蛋白质中，因此作者们希望通过筛选优化得到OspF/SpvC的单磷酸化底物序列，继而借助OspF/SpvC催化实现Dha的有效引入。
首先，作者们借助基质辅助激光解吸-电离质谱 (SAMDI-MS) 和肽阵列技术对OspF/SpvC 底物特异性进行分析。作者首先根据OspF/SpvC的天然底物序列设计了一个包含361个单磷酸化肽段的底物库（序列为 Ac-GX –1 -pT-X +1 GRC，其中 X +1和 X –1是除了cystine 之外的19 种氨基酸），借助肽末端的半胱氨酸残基偶联到修饰有马来酰亚胺的镀金肽阵列上。接着作者将OspF/SpvC加到阵列上，反应2h后洗涤，通过SAMDI-MS进行检测。如果OspF/SpvC识别并催化了底物肽，就能观察到Δ=-98 Da的产物质谱峰。通过计算不同肽段的转化率来反应酶的活性，热图分析表明：当X +1和 X –1是芳香族氨基酸 Phe、Tyr 和 Trp 时，酶对其催化活性最好。
接着作者对底物特异性的分子机制进行分析。他们先利用化学信息学对数据进行处理和回归模型训练，预测每个氨基酸残基的理论平均转化率。同时借助蛋白-多肽对接程序HPEPDOCK对结合模式进行预测，并计算理论结合能。结果显示，理论分析结果与实验筛选的结论具有良好的一致性。进一步的结构分析表明：OspF的底物结合口袋包括中间亲水区和两侧的疏水区，当 X +1和 X –1是芳香族氨基酸时，底物和酶口袋之间会形成更强的疏水相互作用，从而提高了酶促反应效率。随后作者利用筛选得到的结果对单磷酸化肽段进行了进一步的优化，通过酶促反应的动力学分析进一步证明将 ±1 位置的M/G 替换为 Y/W可以明显增加肽和磷酸裂合酶的结合亲和力，使得催化效率整体提高 2.8-5.8倍。
图3. OspF /SpvC底物特异性的结构基础和定量分析
然后作者尝试利用该策略对优化后的底物肽进行标记。他们先用OspF 处理单磷酸肽 R/CDEY-pS/pT-WYV，再加入硫醇反应物，MS分析表明反应得到的Dha可以高效与硫醇加成反应（转化率75-92%），而Dhb因为亲电性较弱几乎没有反应。随后的定量分析表明优化后单磷酸化肽段的反应效率可提高6.5-10倍。
图4. OspF介导的 Dha 插入及位点特异性多肽标记
最后作者们使用优化后的单磷酸化标签对蛋白质和细胞进行标记。他们首先利用SrtA将单磷酸化短肽连接到GFP-LPETG上，然后用OspF处理偶联后的蛋白引入Dha，接着加入硫醇-PEG-生物素进行标记。蛋白质印迹分析表明：偶联有优化后单磷酸化短肽的GFP可以被生物素标记，进而被链霉亲和素-HRP 可视化，而偶联非优化短肽的则无法被标记。此外，作者使用类似的策略，在过表达跨膜蛋白Lpp-OmpA-LPETG的大肠杆菌上引入OspF 识别基序 Y-pS-W，使用OspF将硫醇-PEG-罗丹明成功标记到了细菌表面（标记组荧光信号明显强于对照组）。
图5. OspF介导的 Dha 酶促掺入和蛋白质、活细胞标记
总的来说，作者们借助基于SAMDI-MS等技术对OspF/SpvC的单磷酸化底物进行了系统高效筛选，得到了能被OspF/SpvC高效催化的单磷酸化多肽标签，提高了在温和酶促条件下向多肽或蛋白上引入Dha/Dhb的效率，最后借助该策略成功对GFP和大肠杆菌跨膜蛋白进行了标记。
ACS Chemical Biology, 2022, ASAP
Publication Date: February 7, 2022
https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00866
Copyright © 2022 American Chemical Society
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