近年来，随着蛋白类临床药物数量的快速增长，精准、高效的蛋白质定点修饰技术已成为化学生物学的研究焦点之一。由于C端羧基的氧化还原电势与侧链羧基接近，相比于其它位点的修饰方法，蛋白质C端精准修饰策略发展晚、数量少，且现有的蛋白质C端修饰方法存在遗留额外残基（“连接疤痕”）、蛋白序列受限、底物制备困难等缺陷。因此，建立一种同时具有蛋白序列与修饰基团广谱性的C端无痕修饰方法，不仅能拓宽新型蛋白药物的开发空间，亦可为合成人工设计蛋白元件提供重要技术支撑。

中科院微生物所吴边团队长期从事微生物碳氮成键酶的机制解析与设计重构工作，在多种酰胺成键酶的改造与应用方面取得了原始创新成果（ACS Catal. 2016, 6: 5405–5414；Adv Synth. Catal. 2016, 358: 2140–2147），并以此为基础建立了酶促蛋白质无痕合成平台PALME（Natl. Sci. Rev. 2022, 9: nwab158）。近日，该团队在《ACS Catalysis》报道了关于酶促蛋白质C端无痕修饰的成果。团队成员以此前运用蛋白质计算设计策略获得的超稳定多肽酰胺酶PAM12A为基础，针对组成亲核试剂口袋的残基建立突变体文库，经过三轮筛选，获得底物谱从肼试剂扩展到胺试剂的突变体PAM15。结构分析显示，N125G/M171G/I251G/I254G四突变重塑了活性中心，亲核试剂口袋的空间位阻大幅降低。

图1  稳定性与活性双阶段改造

图2  改造前后活性中心结构对比

（灰色为PAM12A，紫色为PAM15）

实验表明，PAM15兼具广阔的多肽序列与亲核试剂底物谱。PAM15既可利用肼、羟胺等小位阻亲核试剂，又可利用炔丙胺、环丙胺、2-氨基乙氧胺等位阻较大的亲核试剂，选择性修饰多肽的C端酰胺，反应可在室温、水相条件下快速完成（< 1 h）。

图3  PAM15的亲核试剂底物谱（左）与多肽序列底物谱（右）

除了化学合成的多肽，在蛋白酰甘氨酸氧化酶（PHM）与裂解酶（PAL）的辅助下，PAM15亦可修饰重组表达的蛋白，引入的炔基作为click反应的功能基团，能进一步连接生物素、荧光素等常用的商业探针。

图4  酶促蛋白质C端无痕修饰

该项工作不仅在蛋白质定点修饰方面取得了重要突破，也为酰胺成键酶的改造提供了一个参考案例。由于内在的邻位效应，在相同反应条件下氧酯的氨解效率一般低于硫酯，因此天然的酰胺成键酶大多以半胱氨酸为亲核进攻残基。此前领域内已有少数将丝氨酸水解酶改造为酰胺成键酶的工作，但集中于将亲核进攻的丝氨酸替换为半胱氨酸，或是增强酶与蛋白（酰基供体）之间的相互作用，导致蛋白序列受限且需要使用氧酯、硫酯等高度活化的底物。该项工作则另辟蹊径，不改变催化三联体以及蛋白结合口袋的残基，而是改造亲核试剂（酰基受体）口袋，为酰胺成键反应的深层机制探讨提供了新的研究对象。此外，在PAM的内部引入四个甘氨酸残基，形成了有利于稳定亲核试剂进攻构象的口袋结构，但也大幅降低了酶骨架的稳定性（T_m值下降33℃），这体现出以前期改造获得的超稳定多肽酰胺酶PAM12A（T_m=81℃）作为进化起点的必要性。目前吴边团队已将提升PAM稳定性所使用的计算设计策略整合优化，搭建在线计算平台“GRAPE”（https://nmdc.cn/grape-web）并向科研用户免费开放使用。

中国科学院微生物研究所的博士研究生朱彤与崔颖璐副研究员为该项研究的共同第一作者，吴边研究员为通讯作者。该项研究得到了国家重点研发计划绿色生物制造专项、国家自然科学基金优秀青年基金项目、国家自然科学基金面上项目、中国科学院先导专项、中国科学院前沿科学研究计划“从0到1”原始创新项目、中国科学院战略生物资源服务网络计划生物资源衍生库、中国科学院网络安全和信息化专项应用示范项目以及中国科学院青年创新促进会的资助。